高脂血癥對大鼠腦組織MMP-2表達及新生血管的影響*

張振強，賈亞泉，宋軍營，李澎濤，潘彥舒，王叢笑，呂歡歡

1)河南中醫(yī)學院科技處 鄭州 450008 2)北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內科重點實驗室 北京 100029

高脂血癥能夠通過損傷內皮細胞，分泌炎癥因子和生長因子，誘導單核細胞集聚、黏附于內皮細胞，并遷入內皮下間隙，引起T淋巴細胞的浸潤，參與炎癥與免疫過程。單核細胞集聚經多種受體介導，不斷地攝取已經進入內膜發(fā)生氧化的脂質，形成單核細胞源性泡沫細胞；內皮細胞更新、增生并分泌生長因子，可激活動脈中膜平滑肌細胞,經內彈力膜的窗孔遷入內膜，并發(fā)生增生、轉化、分泌細胞因子及合成細胞外基質，經其表面受體介導吞噬脂質，形成平滑肌源性泡沫細胞。在動脈粥樣硬化病變過程中，小動脈內徑狹窄甚至閉鎖，腦組織可出現(xiàn)慢性缺血缺氧，機體能否通過血管新生的方式來代償腦內的病理變化過程，從而實現(xiàn)腦保護作用，該實驗將進行驗證分析。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組健康雄性SPF級12周齡Wistar大鼠20只，體質量280～300 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2007-0001]，質量合格證號：0243109。實驗動物采用隨機數字表法分為正常對照組、高脂血癥組，每組10只。

1.2主要儀器與試劑主要儀器：全自動生化分析儀(奧林巴斯，型號AU2700)；酶標儀(Thermo，型號MK3)；洗板機(Thermo，型號WELLWASH4MK2)；自動平衡離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司，型號TDZ5-WS)；DT300A型電子天平(上海醫(yī)用激光儀器廠常熟分廠)。主要試劑：體積分數10%水合氯醛(武漢市和昌化工有限公司)；PBS緩沖液(上海富眾生物科技發(fā)展有限公司)；基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、人白細胞分化抗原34(CD34)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)一抗、二抗及鏈霉菌素-過氧化物酶溶液(武漢博士德生物工程有限公司)；VEGF ELISA檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3高脂血癥動物模型制備方法高脂血癥組大鼠每天以高脂飼料[組成成分(質量分數)：3.5%膽固醇、10.0%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5.0%白糖、80.8%基礎飼料]喂養(yǎng)[1]，正常對照組以正常飼料喂養(yǎng)，4周后正常對照組與高脂血癥組分別斷尾取血0.5～1.0 mL檢測血脂，高脂血癥組血脂指標與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，則說明模型制備成功[2]，否則繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.4血脂檢測模型制備成功后，每組各取動物5只，以體積分數10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，腹主動脈取血5 mL，靜置30 min，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，-20 ℃冰箱冷凍備用。血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)用全自動生化分析儀進行檢測。

1.5血清VEGF含量檢測采用ELISA法檢測血清中VEGF的含量，依照試劑盒說明書步驟進行操作。

1.6腦組織MMP-2、ICAM-1、CD34、VEGF免疫組化染色及HE染色每組各取動物5只，以體積分數10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，背位固定于鼠板上，剪開胸腔，暴露出心臟，先用手術剪剪開右心耳，再用100 mL注射器進入左心室插進主動脈，先灌注生理鹽水150 mL左右，再灌注多聚甲醛400 mL左右，斷頭取出全腦，腦組織置于40 g/L多聚甲醛固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、冠狀切片，片厚4 μm，制作常規(guī)病理切片，進行HE染色和免疫組化染色，在高倍鏡(×400)下選取5個視野計數陽性細胞(棕黃色染色)，結果取平均值(個/mm2)。

1.7統(tǒng)計學處理應用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學處理，2組血脂、血清VEGF含量及腦組織VEGF、MMP-2、 ICAM-1和CD34表達情況的比較均采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組TC、TG、HDL-C、LDL-C檢測結果見表1。

2.2 2組腦組織病理學觀察結果見圖1。與正常對照組相比，HE染色顯示高脂血癥組大鼠毛細血管增多；神經細胞較多，少量神經元固縮；星型膠質細胞增生較明顯；細胞形態(tài)結構基本正常。免疫組化結果顯示：高脂血癥組大鼠腦組織內MMP-2主要表達在皮層及海馬區(qū)；CD34陽性細胞增多，主要分布于新生毛細血管；VEGF和ICAM-1表達均增多。

2.3 2組血清VEGF含量及腦組織MMP-2、ICAM-1、CD34和VEGF表達結果見表2。

表1 2組血脂檢測結果 mmol/L

圖1 2組腦組織HE染色和免疫組化結果(×400)

表2 2組大鼠血清VEGF含量和腦組織MMP-2、ICAM-1、CD34、VEGF的表達

3 討論

MMP-2主要由血管內皮細胞、星形膠質細胞、白細胞等合成和分泌，主要功能為降解細胞外基質，促使組織細胞的再生及遷移；正常情況下含量極少，但當有炎癥反應時，在IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF、PDGF等作用下，能夠活化上述細胞。胞內線粒體和溶酶體增多，一方面起到吞噬細胞碎片和壞死組織作用，另一方面釋放包括MMP-2在內的各種酶類，破壞基底膜的毛細血管內皮細胞的緊密連接，引起組織細胞的炎癥性水腫[3-4]，所以MMP-2在腦組織的表達有雙向性，既可損傷組織，又有清除與修復組織的作用[5-6]。該研究顯示，高脂血癥組大鼠腦組織內MMP-2表達比對照組增多，主要表達于皮層及海馬區(qū)，但是沒有發(fā)現(xiàn)腦細胞水腫及腦功能明顯損害，推測MMP-2可能起到組織修復作用。由于高脂血癥是一個慢性病變過程，MMP-2高表達可能是激活內源性保護的機制之一。

內皮功能障礙時，ICAM-1能夠使血流中的單核細胞與血管內皮細胞黏附，進入內皮下基質集聚。有研究[7-10]證實，慢性缺氧時其黏附功能增強，可促使內皮細胞分化和遷移，參與血管生成。該研究結果顯示高脂血癥組大鼠腦組織ICAM-1表達增多，而CD34表達的增多提示了新生血管較多，ICAM-1可能參與了血管的生成。因為CD34是一種跨膜糖蛋白，有黏附、促血管前內皮細胞聚集并形成血管、調控造血細胞增殖和分化的功能[11-12]。

VEGF對血管形成有關鍵而且特異性作用，腦血管發(fā)生的主要方式是通過VEGF與血管內皮細胞上的2個酪氨酸激酶受體(VEGFR-1和VEGFR-2)結合啟動血管新生的最初始過程——出芽，形成未成熟的血管[11]。VEGF主要生物學功能有：①促進微血管內皮細胞增殖、遷移。②增加微血管通透性，有助于再通血管，促進周圍側支循環(huán)建立。③通過改變內皮細胞的基因表達，產生蛋白水解酶，降解細胞外基質，促進生長的毛細血管向基質遷移。在炎癥、缺氧等因素作用下，通過內皮細胞、炎癥細胞、結締組織等產生促使血管內皮細胞生長活性物質，在毛細血管和細靜脈的基礎上誘導新生血管的形成[7,13]。該研究結果顯示，無論是大鼠血清中還是腦組織中VEGF的表達都是增加的，推測高脂血癥對腦內血管生成具有一定影響，這可能是體內的一種內源性保護機制之一。

腦組織細胞在炎癥因子、各種趨化因子等因素作用下，會發(fā)生一系列的病理反應，包括膠質細胞、內皮細胞、基質成分等結構和功能的改變，對神經元、神經纖維及神經突觸造成影響。作者發(fā)現(xiàn)高脂血癥組和正常對照組相比較，光鏡下大腦皮質毛細血管增多，神經細胞少量固縮；膠質細胞數量增多，主要集中在小血管周圍，形態(tài)結構基本正常。高脂血癥可以損傷血管內皮細胞，引起動脈粥樣硬化等病理變化，從而使腦組織出現(xiàn)相對的、慢性的缺血缺氧，機體對抗這種變化，啟動內源性保護機制。該研究結果表明模型大鼠腦組織MMP-2表達及新生血管的變化，可能是高脂血癥誘發(fā)機體腦組織內源性保護機制之一，其詳細的作用機制尚需進一步深入研究。

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