原發性肝細胞癌組織中血管緊張素轉化酶Ⅱ與血管緊張素Ⅱ1型受體的表達*

許亞坡，周 琳，王春峰，張連峰

鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床常見的富血管惡性腫瘤，生長快，易轉移和浸潤，總體預后較差，5 a生存率僅為3%～5%[1]。我國乙型肝炎病毒攜帶者約占全球的1/3[2],肝癌發病人數占到了全球的55%[3]，嚴重影響著人們的健康。血管緊張素轉化酶Ⅱ(angiotensin converting enzyme Ⅱ，ACE2)是目前發現的惟一的ACE同工酶[4]，但有關ACE2與HCC可能的關系及其臨床意義方面國內外均無相關報道。該研究采用免疫組化法對HCC、癌旁肝硬化及正常組織的ACE2和血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)蛋白表達進行檢測，旨在探討兩者在HCC組織中的表達情況、相互關系及在HCC發病中的意義，有望為HCC的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1標本及試劑選取鄭州大學第一附屬醫院2011年6月至2012年6月經外科手術切除的HCC組織標本82例及非同一批HCC患者遠離癌灶無浸潤的肝硬化組織標本40例(男24例，女16例，年齡31～69歲，中位年齡50歲)，取同期肝血管瘤旁的正常肝組織標本24例(男14例，女10例，年齡28～68歲，中位年齡48歲)作對照，以上均為存檔蠟塊，并經病理醫師證實。HCC患者中男57例，女25例；年齡33～75歲，中位年齡54歲，其中<50歲者28例，≥50歲者54例；術前均未接受放化療及免疫治療；其中高分化癌24例，中分化癌32例，低分化癌26例；腫瘤直徑<5 cm者36例，≥5 cm者46例；有門脈浸潤者37例，無浸潤者45例；TNM臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期49例。ACE2及AT1R兔抗人多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2ACE2及AT1R蛋白的免疫組化檢測操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，標本均經體積分數10%甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片。脫蠟水化，檸檬酸緩沖液抗原高溫、高壓修復，體積分數3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，血清封閉非特異性抗原，滴加抗AT1R或ACE2一抗(均為1200稀釋)，4 ℃過夜，滴加生物素標記的二抗，孵育后DAB顯色，蘇木素復染，經脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。實驗中以已知的陽性組織作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3結果判斷AT1R及ACE2均著色在細胞的胞質和胞膜上，AT1R陽性染色表現為淺黃色、棕黃色或棕褐色，ACE2為淺黃色、棕黃色或深棕色。所有切片均在高倍鏡(×400)下觀察10個視野，根據陽性細胞著色程度及陽性細胞百分比進行評分。著色程度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色或棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞百分比<25%為1分，25%～為2分，50%～為3分，75%～為4分。結果取2項評分之和，<10分為陰性，≥10分為陽性[5]。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0進行統計分析，對3種組織中AT1R及ACE2蛋白陽性率的比較采用χ2檢驗，對二者與HCC組織不同病理特征之間的關系采用χ2檢驗進行分析，HCC組織中二者的相關性分析采用列聯系數，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1AT1R及ACE2蛋白在3種組織中的表達結果見圖1和表1。

圖1 AT1R(1)和ACE2(2)蛋白在HCC(A)、肝硬化(B)和正常肝(C)組織中的表達情況(SP,×400)

表1 AT1R及ACE2蛋白在HCC、肝硬化和正常肝組織中的表達情況 例(%)

*:3組間兩兩比較，P均<0.016；#：與正常肝組織比較，P均<0.016。

2.2AT1R及ACE2蛋白表達與HCC臨床病理特征之間的關系兩者在HCC組織中的表達均與腫瘤的分化程度、臨床分期及門脈浸潤有關，而與患者性別、年齡及腫瘤大小無關，見表2。

表2 HCC組織中AT1R及ACE2的表達與臨床病理特征的關系 例(%)

*:校正χ2檢驗。

2.3HCC組織中AT1R及ACE2蛋白表達的相關性分析兩者在HCC組織中的表達有關，見表3。

表3 HCC組織中AT1R及ACE2蛋白表達的關系 例

rP=0.543，P<0.001。

3 討論

腎素-血管緊張素系統(RAS)是人體內重要的內分泌系統，目前對其認識多集中在對心血管系統的作用上，參與高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭等疾病的發生發展[6]。肝臟組織出現炎癥、壞死時，RAS系統變得活躍，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)及AT1R增多，通過激活肝星狀細胞促進肝纖維化及肝硬化的形成。活躍的RAS系統可通過誘導血管內皮生長因子等活性成分的增加促使腫瘤血管的形成[7]，從而為腫瘤細胞提供營養，這可能是HCC組織中AT1R蛋白高表達的重要原因。有研究[8]已經證實RAS系統的拮抗劑可通過抑制AngⅡ起到抗纖維化的作用。

ACE2是目前發現的惟一的ACE同工酶。ACE2最重要的作用是使AngⅡ失活，將之水解生成活性七肽Ang-(1-7)，并作用于特異性的Mas受體，進而發揮其拮抗AngⅡ的作用，產生抗炎、抗纖維化等效應[9]。ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸被認為是ACE-AngⅡ-AT1R的反向調節軸[10]。有研究[11]表明ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸對肝臟具有保護作用。該研究結果顯示HCC組織中ACE2的表達明顯高于正常組織，說明在AT1R作用軸與肝臟病變相互促進的同時，ACE2作用軸也被激發，并可能發揮反向調節而遏制病變的效應。其保護肝臟的機制可能與ACE2可以消除AngⅡ的縮血管作用，增加局部供氧、抗纖維化有關[12-13]。與AT1R一樣，ACE2也與腫瘤的發病密切相關。對胰腺癌的研究[14]已經發現ACE2具有抑制胰腺癌發生發展的作用。該研究發現HCC組織中ACE2蛋白的表達相比正常組織升高，說明ACE2作用軸同樣也貫穿在HCC的發生發展中。

RAS系統的活性還與臨床上肝病的臨床特征、病理分級等密切相關。該研究發現HCC組織中ACE2與AT1R的表達有關，且均與腫瘤分化程度、臨床分期及門脈浸潤密切相關，而與性別、年齡、腫瘤大小無關。這也說明ACE2及AT1R兩者參與HCC發生發展的全過程，能反映其嚴重程度，有助于早期診斷和預后判斷。

綜上所述，該研究發現ACE2及AT1R在HCC組織中表達均較正常組織升高，并且其表達與分化程度、臨床分期等有密切關系，這預示著二者在HCC發病的過程中起著重要作用。進一步對其作用機制的研究有望為HCC的診斷與預后判斷，尤其是為治療開辟新的途徑。

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