活性維生素D3對糖尿病大鼠腎臟BMP-7及TGF-β1表達的影響

楊瑞鳳，王建生，張宛哲，趙瑛瑛，孟晶茜，申鵬霄，張文吉

鄭州大學第二附屬醫院腎內科 鄭州 450014

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常見的并發癥，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一[1]，其確切的發病機制尚未完全清楚，目前治療效果不理想。活性維生素D3的生物學作用廣泛，其功能研究集中在調節鈣磷代謝、細胞增生與分化、骨的再建及免疫調節[2]方面，近年來活性維生素D3的腎保護作用越來越受關注。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)高表達是導致糖尿病腎損害的重要環節。骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein-7, BMP-7)又稱成骨蛋白-1，屬轉化生長因子超家族，能促進新骨的生成及修復，促進成骨細胞與軟骨細胞的分化，是重要的腎保護因子，可通過抑制TGF-β1發揮抗腎纖維化作用[3]。作者觀察了活性維生素D3對糖尿病大鼠腎臟BMP-7和TGF-β1表達的影響，探討活性維生素D3腎臟保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司；骨化三醇，上海羅氏公司；全自動生化儀(日立7600-010)；兔抗大鼠BMP-7多克隆抗體，北京博奧森公司；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體，Santa Cruz公司；Trizol及RT-PCR試劑盒，北京全式金生物有限公司；免疫組化試劑盒及免疫熒光試劑盒，北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.2實驗分組雄性SD大鼠36只，體質量225～275 g，由鄭州大學實驗動物中心提供。大鼠禁食不禁飲12 h后，隨機取24只一次性腹腔注射60 mg/kg STZ(STZ用0.1 mmol/L無菌枸櫞酸緩沖液配制，pH4.5)[4]，72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖>16.7 mmol/L者為糖尿病大鼠，共造模成功22只。將22只大鼠隨機分成糖尿病模型(DM)組，活性維生素D3(DC)組，每組各11只。余12只大鼠隨機選取11只為正常對照(NC)組。DC組在模型建立后，將骨化三醇溶于0.05 mL花生油以0.03 μg/(kg·d)的劑量灌胃[5]，NC組與DM組給予等量的花生油灌胃。實驗期間大鼠均給予標準飲食，自由飲水，12 h光照周期，12周后處死，期間每組各死1只。處死前收集4～6 mL靜脈血、24 h尿。切取雙側腎臟，稱重，計算腎臟肥大指數，腎臟肥大指數=腎質量/體質量。取部分腎組織常規制片，其余腎組織液氮保存。

1.3腎組織形態學觀察常規石蠟切片，PAS及Masson染色，觀察腎小球基底膜、系膜區、腎小管及腎間質的改變。

1.4生化指標檢測采用全自動生化儀檢測24 h尿蛋白定量、血鈣(Ca)、血尿素氮(BUN)、胱抑素C(Cys-C)、血肌酐(Scr)。

1.5腎組織BMP-7、TGF-β1mRNA的檢測采用RT-PCR法檢測。取約100 mg腎皮質按照Trizol說明書提取總RNA，取5 μg反轉錄成cDNA，進行PCR擴增。引物由北京博大泰克公司合成。BMP-7引物序列：上游5’-AAACAGCAGCAGTGACCAGA-3’，下游5’-GTCGTCGAAGTAGAGGACAGATA-3’，退火溫度55 ℃，擴增產物長度為274 bp；TGF-β1引物序列：上游5’-CATCCCGCCCACTTTCTAC-3’，下游5’-CAAGCAGGTCACCATTTCA-3’ ，退火溫度54 ℃，擴增產物長度1 759 bp；β-actin引物序列：上游5’-CCCATCTATGAGGGTTAC-3’，下游5’-GGAAGGTG GACAGTGAG-3’，退火溫度58 ℃，擴增產物長度568 bp。產物經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用紫外線投射儀觀察，用凝膠成像分析系統測定條帶的吸光度，以目的基因與內參條帶吸光度的比值表示目的基因mRNA的表達水平。

1.6腎組織BMP-7、TGF-β1蛋白的檢測石蠟切片脫蠟水化后，用體積分數3% H2O2處理內源性過氧化氫酶，抗原熱修復，山羊血清封閉后，分別滴加兔抗大鼠BMP-7多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(均按100倍稀釋)。37 ℃孵化30 min，4 ℃過夜。加入生物素二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。陽性信號為棕黃色著色。應用病理圖像分析系統(上海山富科學儀器有限公司)做半定量分析，每個切片測定20個含腎小球的視野(×200)，測定陽性區積分光密度值，取均值作為最終結果。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0進行統計分析，3組間腎臟肥大指數、生化指標、腎組織中TGF-β1和BMP-7 mRNA及蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1腎組織形態學表現見圖1。NC組大鼠腎小球、腎小管結構清楚，基底膜厚度均一，毛細血管腔開放良好,間質未見炎性細胞浸潤、纖維組織增生。DM組腎小球體積明顯增大，基底膜增厚,系膜基質明顯增多，部分毛細血管襻融合、擴張，部分腎小管上皮細胞腫脹，腎間質可見大量的淋巴細胞浸潤，纖維成分明顯增多。DC組系膜細胞及基質增生減輕，病變較DM組減輕。

圖1 3組大鼠腎組織病理改變(×400)

2.2 3組大鼠腎臟肥大指數及生化指標的比較見表1。

表1 3組腎臟肥大指數、24 h尿蛋白定量、血Ca、血BUN、Cys-C及Scr的比較

*：與NC組比較，P<0.05；#：與DM組比較,P<0.01。

2.3 3組大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1mRNA的表達見圖2、表2。

2.4 3組大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1蛋白的表達見圖3、表3。

圖2 3組大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1 mRNA的表達

表2 3組腎組織中BMP-7、TGF-β1 mRNA的表達

*：與NC組比較,P<0.05;#：與DM組比較,P<0.05。

圖3 3組大鼠腎組織BMP-7、TGF-β1蛋白的表達(×200)

表3 3組腎組織BMP-7、TGF-β1蛋白表達

*:與NC組比較,P<0.05;#:與DM組比較,P<0.05。

3 討論

中國糖尿病流行病學調查顯示，我國已超過印度成為世界上糖尿病患者最多的國家[6]，DN患病率也逐年增加，在我國已成為導致終末期腎功能衰竭的主要原因。目前DN的防治手段有限，主要為對癥治療，探索新的治療方法日趨迫切。

越來越多的研究[7]表明活性維生素D3不僅具有調節鈣磷代謝作用，而且還具有抗增殖、抗分化、調節細胞凋亡、介導免疫反應等腎臟保護作用，但其具體作用機制尚不完全清楚。已證實TGF-β1可通過抑制細胞增殖、促進腎組織肥大、誘導細胞外基質表達等多種途徑導致糖尿病腎組織病理改變。Aschenbrenner等[8]研究證實，活性維生素D3可以通過抑制TGF-β1信號途徑Smads通路，有效延遲Fisher-Lewis慢性同種異體移植模型大鼠慢性移植腎病的發生。維生素D3還可以顯著抑制系膜增生性腎炎模型大鼠腎組織中TGF-β1的表達以及Ⅰ型、Ⅳ型膠原和α平滑肌肌動蛋白的表達，抑制系膜細胞的增殖和腎小球的硬化[9]。Zhang等[10]發現維生素D3可抑制維生素D受體敲除糖尿病模型大鼠RAS系統及系膜細胞、近球細胞中TGF-β1的表達，進而減少尿蛋白，抑制腎小球肥大及腎小球硬化。該研究結果顯示，DM組大鼠腎組織TGF-β1 mRNA及蛋白的表達較NC組明顯升高，DC組大鼠腎組織中TGF-β1 mRNA及蛋白的表達均較DM組明顯下降，同時尿蛋白明顯減少，病理改變減輕，表明活性維生素D3可通過下調TGF-β1表達在DN發生發展過程中發揮保護作用。

BMP-7與TGF-β1雖同屬轉化生長因子超家族的成員，但作用完全不同，BMP-7可拮抗TGF-β1引起的纖維化及上皮間質轉化[11]，是腎臟保護因子，在多個器官中均發揮著重要作用，若腎臟早期發育中缺乏BMP-7會導致腎單位發育停止。Wang等[12]發現，在轉BMP-7基因的糖尿病大鼠中，BMP-7不僅可通過抑制足細胞的脫落而減少尿蛋白，而且可減少膠原蛋白Ⅰ及纖連蛋白的表達,從而延緩腎小球硬化及間質纖維化。該研究結果顯示：無論是在RNA水平還是蛋白水平，DM組腎組織BMP-7的表達均較NC組明顯減少，提示BMP-7對糖尿病腎組織具有重要作用，其減少可能加重糖尿病腎臟損害；與DM組相比，DC組大鼠腎臟肥大指數下降，腎臟病理改變明顯減輕，24 h尿蛋白明顯減少，血肌酐及尿素氮下降，提示活性維生素D3亦可通過上調腎組織中BMP-7的表達而發揮腎保護作用。

維生素D缺乏在DN患者中普遍存在，1,25(OH)2D3較25(OH)D3缺乏更明顯[13]。該研究結果顯示，在STZ誘導的糖尿病大鼠腎組織中BMP-7表達減少，TGF-β1表達增加，而活性維生素D3在糖尿病腎病中發揮腎臟保護作用，其作用機制可能與上調BMP-7、下調TGF-β1的表達密切相關，但對于活性維生素D3通過何種途徑發揮上述作用，還有待進一步研究。

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