結直腸癌組織和結腸癌細胞中miR-31的表達及功能*

王朝杰，馬 寧，周 云

河南省人民醫院(鄭州大學人民醫院)腫瘤科 鄭州 450003

2002年，Calin等[1]首先在慢性B淋巴細胞白血病中發現miR-15a和miR-16在68%的患者中缺失或表達下調，從此人們把microRNA和腫瘤聯系起來。在隨后的十余年里，microRNA和腫瘤發生、發展的研究逐漸深入，microRNA有可能成為腫瘤診斷的標志物和治療的新靶點[2-3]。人miR-31首先在HeLa細胞中被發現，定位于染色體9p21.3[4]。miR-31在結直腸癌組織中表達上調已被諸多實驗[5-6]所證實。作者研究了結直腸癌組織中miR-31的表達，并對miR-31的功能進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1臨床標本的收集及處理收集2011年10月至2012年6月在河南省人民醫院診治的98例結直腸腺癌患者的臨床資料。男51例，女47例，年齡24～83(54.3±15.1)歲。入選病例術前未行放、化療，無其他腫瘤病史。收集患者腫瘤標本及距離腫瘤邊緣5 cm以上的正常結直腸黏膜組織(均經病理證實)標本，一部分保存于-80 ℃冰箱，備RNA提取，剩余部分用體積分數10%甲醛固定24 h,常規石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下觀察。98例中局部浸潤T1+T2+T3 62例，T4 36例；12例有脈管浸潤。高分化1例，中分化68例，低分化29例。TNM Ⅰ期16例，Ⅱ期29例，Ⅲ期48例，Ⅳ期5例。其中27例患者有血清癌胚抗原水平資料。

1.2組織中miR-31表達水平的測定取約50 mg組織，剪碎，Trizol(美國分子研究中心)法提取總RNA，-80 ℃保存。按照TaKaRa逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)逆轉錄生成cDNA，-20 ℃保存備用。miR-31逆轉錄莖環引物序列如下：5’-GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCACTG GATACGACCAGCTA-3’(Invitrogen上海生物有限公司)。內參基因5S rRNA應用隨機引物(TaKaRa)進行逆轉錄。根據表1引物及探針序列行PCR擴增。PCR反應體系如下：10×Mg2+free PCR Buffer3.0 μL，25 mmol/L MgCl23.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 3.6 μL，20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，10 μmol/LTaqMan探針1.0 μL，5×106U/L的Taq酶0.3 μL，ddH2O 17.1 μL，cDNA 1.0 μL。陰性對照用ddH2O代替cDNA。實時熒光定量PCR反應程序如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火25 s，60 ℃延伸35 s，40個循環。目的基因的表達量：R=E目的ΔCT目的/E內參ΔCT內參。R表示經內參基因標準化后，腫瘤組織相對于正常結腸黏膜組織目的基因的變化倍數。R>1.0表示腫瘤組織目的基因表達上調，<1.0表示目的基因表達下調。E表示擴增效率;ΔCT表示對照黏膜與腫瘤組織中目的基因的Ct值之差。

表1 miR-31及內參5S rRNA的PCR引物及探針序列

1.3細胞實驗

1.3.1 細胞培養 人結腸癌細胞系HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-(瑞典林雪平大學腫瘤中心惠贈)在McCoy’s 5A 培養液 (瑞典Sigma-Aldrich公司) 中培養，其中添加體積分數10%胎牛血清及體積分數1% PEST和1.5 mmol/L的L-glutamine (美國Invitrogen公司)。

1.3.2 轉染前后miR-31表達水平的測定 以2×103個/孔接種細胞于96孔板，按照轉染試劑盒siPORTTMNeoFXTM(美國Applied Biosystems) 的操作說明操作，轉染終濃度為100 nmol/L的Anti-miRTMmiR-31 抑制劑(anti-miR-31)或Anti-miRTM陰性對照(美國Applied Biosystems)。同1.2方法采用實時熒光定量PCR測miR-31的表達，結果用REST處理。

1.3.3 轉染前后細胞增殖檢測 以2×103個/孔接種細胞于96孔板，分別轉染100 nmol/L anti-miR-31或陰性對照。轉染24、48、72、96 h后，每孔加入5 g/L的MTT各20 μL，37 ℃孵育4 h后，加入二甲基亞砜150 μL/孔，振蕩10 min，在490 nm下讀取吸光度值。

1.3.4 轉染前后細胞周期分析 24孔板每孔接種2.7×104個細胞，分別轉染100 nmol/L anti-miR-31或陰性對照，48 h后消化細胞，PI染色，用FACScan (美國Becton-Dickinsson)行流式分析，數據應用ModFit LT for Mac V 3.1軟件進行分析。

1.3.5 細胞遷移實驗 采用QCMTM24孔細胞遷移實驗 (美國Millipore Corporation)，按照說明書要求進行。主要步驟如下：細胞轉染24 h后，在無血清培養基中饑餓培養12 h。收集細胞，4×104個細胞懸浮于300 μL無血清培養基中，種植于上室內。下室內加入500 μL含體積分數10%胎牛血清的培養基。16 h后，小心吸去上室內的培養液及細胞，并用棉簽小心擦去膜上面尚未遷移的細胞，膜下面的細胞即為發生遷移的細胞。染色后每個膜選擇5個有代表性的視野進行照相并計數，記錄穿膜細胞數。

1.4統計學處理實時熒光定量PCR所得數據經對數轉化后作為miR-31的相對表達量。miR-31在腫瘤組織中的整體相對表達變化及細胞轉染前后miR-31的變化測定用REST分析(http://www.wzw.tum.de/gene-quantification)。應用SPSS 11.5處理數據，采用兩獨立樣本的t檢驗比較結直腸癌患者miR-31的相對表達量和臨床病理指標的關系；采用2×4析因設計的方差分析觀察轉染anti-miR-31不同時間對HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞增殖的影響，采用兩獨立樣本的t檢驗比較轉染anti-miR-31對細胞周期分布及遷移能力的影響，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1結直腸癌組織中miR-31的表達98例結直腸癌組織中，89例(91%)miR-31的表達上調，REST分析表明結直腸癌組織中miR-31的表達升高，是正常黏膜的15倍(P=0.001)。miR-31的表達與結直腸癌患者各指標的關系見表2。

2.2anti-miR-31轉染對2種HCT-116細胞miR-31表達水平的影響實時熒光定量PCR結果顯示，在HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞中，轉染后miR-31的水平分別是轉染前的44.1%和67.8%(P=0.042和0.046)。

2.3anti-miR-31轉染對2種HCT-116細胞增殖的影響見表3、4。anti-miR-31轉染對細胞增殖無明顯影響(P>0.05)。

2.4anti-miR-31轉染對2種HCT-116細胞周期分布的影響見表5、6。anti-miR-31轉染對細胞周期分布無明顯影響(P>0.05)。

表2 miR-31的表達和結直腸癌患者各指標的關系

表3 anti-miR-31轉染對HCT-116p53+/+細胞增殖的影響 (n=3)

F轉染=0.112，P=0.743；F時間=162.187，P<0.001；F交互=0.072，P=0.974。

表4 anti-miR-31轉染對HCT-116p53-/-細胞增殖的影響 (n=3)

F轉染=0.616，P=0.444；F時間=214.951，P<0.001；F交互=0.327，P=0.806。

表5 anti-miR-31轉染對HCT-116p53+/+細胞周期分布的影響 (n=3) %

表6 anti-miR-31轉染對HCT-116p53-/-細胞周期分布的影響 (n=3) %

2.5anti-miR-31轉染對2種HCT-116細胞遷移能力的影響見圖1、表7。anti-miR-31轉染可以明顯降低細胞的遷移能力。

圖1 anti-miR-31轉染對2種HCT-116細胞遷移能力的影響(蘇木素,×400)

表7 anti-miR-31轉染對2種細胞遷移能力的影響

3 討論

炎癥性腸病患者結直腸癌的發病風險明顯升高，從非炎癥到炎癥，再到不典型增生，直至最后癌變，miR-31的表達水平呈逐漸升高的趨勢[7]。該研究結果顯示結直腸癌組織中miR-31的表達水平是正常黏膜組織的15倍，提示miR-31高表達與結直腸癌的發生有關。

Bandrés等[8]在小樣本(10例)研究中發現，miR-31在結直腸腺癌Ⅳ期中的表達高于Ⅱ期；Schee等[9]在大樣本(100例)研究中也發現了miR-31和結直腸腺癌腫瘤分期有關，而Slaby等[5]和Xu等[10]的研究中卻未發現miR-31和結直腸癌腫瘤分期的關系。這種差異的產生除和研究者納入的樣本量大小有關外，還可能和各個實驗室所使用的研究方法不一致有關。該研究結果顯示miR-31的表達和結直腸癌TNM分期及腫瘤局部浸潤有關，推測miR-31可能參與了結直腸癌的發展。

有研究[11]顯示，在結腸癌細胞系LIM1863中，miR-31可抑制TIAM-1，進而調節結腸癌細胞的侵襲和遷移。該研究結果顯示，應用anti-miR-31轉染結腸癌細胞HCT-116后，細胞中miR-31的表達水平降低，然而細胞的增殖及細胞周期并未受到影響，細胞的遷移能力與轉染前相比降低了50%左右，提示抑制miR-31的表達影響結腸癌細胞的侵襲和遷移能力。

總之，miR-31在結直腸癌組織中高表達，且和腫瘤的分期及局部浸潤有關，抑制miR-31的表達可以抑制腫瘤細胞的遷移能力；miR-31有可能成為結直腸癌潛在的診斷指標和治療靶點。

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