結(jié)直腸癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA的表達(dá)及K-ras基因突變的檢測(cè)*

王瑞華，謝建國(guó)，付 強(qiáng)，謝 天，馬 杰，常玉璽

1)上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院消化內(nèi)科 上海 201499 2)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科 鄭州 450008 3)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科 鄭州 450008

腫瘤的血管生成受到多種血管生成因子的調(diào)控，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究關(guān)注促血管生成素家族，尤其促血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)[1]。Ang-2是Tie/angiopoeitin信號(hào)通路的一部分，涉及血管的形成和發(fā)育。Ang-2及其特異性酪氨酸激酶受體-2(tyrosine kinase receptor-2，Tie-2)是腫瘤血管生成的重要調(diào)節(jié)因子[2]。Ang-2/Tie-2信號(hào)通路激活將導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，誘導(dǎo)血管生成[3]。ras基因是最常見(jiàn)的癌基因，它由K-ras、H-ras和N-ras家族組成。研究[4]表明K-ras為大腸癌轉(zhuǎn)化基因，其突變是大腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中早期分子事件之一。作者對(duì)結(jié)直腸癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA的表達(dá)及K-ras基因突變進(jìn)行檢測(cè)、分析，探討其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1組織來(lái)源標(biāo)本來(lái)自鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科2010年6月至2011年6月經(jīng)手術(shù)切除、病理證實(shí)的結(jié)直腸腺癌40例，10例正常大腸組織取自切除腸段的斷端。其中男21例，女19例，年齡27～78歲。高中分化癌31例，低未分化癌9例；Dukes分期：A期4例，B期19例，C期13例，D期4例；大體類型：隆起型22例，潰瘍型16例，浸潤(rùn)型2例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例(包括肝轉(zhuǎn)移4例)；浸潤(rùn)深度：浸潤(rùn)至肌層14例，浸潤(rùn)至漿膜層26例。將組織標(biāo)本裝于凍存管中，迅速置于液氮中保存待檢。

1.2試劑及儀器oligo-(dT)(TaKaRa D510)，Ribonuclease Inhibitor(TaKaRa D2310A)，M-MLV Reverse Transcriptase(Promega M170A)，RNA抽提試劑盒、BioEasy SYBR Green Ⅰ Real-time PCR試劑盒(北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)。其余生化試劑均為進(jìn)口分析純。Line-gene 熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(杭州博日科技有限公司)，DYY-7C型電泳儀及紫外分析儀(北京六一儀器廠)，DYCP-31D型水平式電泳槽(北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司)。

1.3Ang-2、Tie-2mRNA的檢測(cè)采用Real-time PCR法。將組織在液氮中磨碎，裂解勻漿處理后，提取總RNA，取3 μL逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，以此為模板行Real-time PCR。所用引物由北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系: 2×SYBR Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，蒸餾水20.7 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，cDNA 2 μL。以B2微球蛋白(B2-MG)為內(nèi)參。反應(yīng)程序:95 ℃ 120 s；95 ℃ 20 s，59 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。記錄每個(gè)循環(huán)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)值，并描繪曲線。記錄達(dá)閾值的最低循環(huán)數(shù)(Ct值)，以2-ΔΔCt表示目的基因的表達(dá)量[5]。

1.4K-ras基因突變的檢測(cè)采用PCR-SSCP方法。將液氮保存的組織勻漿用蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提，冷無(wú)水乙醇沉淀，0.1×TE溶解，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩-ras基因PCR引物序列參照文獻(xiàn)[2]，由北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司合成，序列見(jiàn)表2。以GAPDH為內(nèi)參。PCR反應(yīng)總體積50 μL，于PCR循環(huán)儀94 ℃變性75 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL與等量加樣緩沖液混合，98 ℃變性10 min，冰浴驟冷5 min，然后加樣在80 g/L聚丙烯酰胺凝膠上電泳5 h,銀染鑒定。

表1 Ang-2、Tie-2及內(nèi)參PCR引物序列

表2 K-ras及內(nèi)參PCR引物序列

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正常和癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA表達(dá)量的比較，以及K-ras基因突變和未突變癌組織中兩者mRNA表達(dá)量的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，對(duì)癌組織中Ang-2和Tie-2 mRNA表達(dá)量行Pearson相關(guān)分析，不同臨床病理特征的癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA高表達(dá)率及K-ras基因突變率的比較采用χ2檢驗(yàn)或精確概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織中Ang-2、Tie-2mRNA的表達(dá)

Ang-2、Tie-2 mRNA溶解曲線都為單峰，說(shuō)明各基因擴(kuò)增產(chǎn)物純凈，未擴(kuò)增出非特異性產(chǎn)物。Ang-2、Tie-2 mRNA擴(kuò)增曲線都呈典型S型，說(shuō)明各基因產(chǎn)物擴(kuò)增正常。Ang-2、Tie-2 mRNA在正常組織中的表達(dá)量均為1，癌組織中分別為(2.92±0.23)、(2.17±0.15)，均較正常組織明顯增高(t=39.960、9.490，P<0.001)。結(jié)直腸癌組織中Ang-2 mRNA與Tie-2 mRNA表達(dá)量呈線性正相關(guān)(r=0.772，P<0.001)。以Ang-2、Tie-2 mRNA表達(dá)量高于2.92和2.17為高表達(dá)，則兩者高表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表3。

表3 Ang-2、Tie-2 mRNA高表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

*：校正χ2。

2.2結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變檢測(cè)結(jié)果40例結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變率為42.5%(17/40)。突變的17例中，11例為12密碼子由GGT到GAT突變，6例為13密碼子由GGC到GAC突變。不同臨床病理特征結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變率的比較見(jiàn)表4。

表4 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變率的比較

*：精確概率法。

2.3結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變與Ang-2、Tie-2mRNA表達(dá)的關(guān)系見(jiàn)表5。

表5 結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變與Ang-2、Tie-2 mRNA表達(dá)的關(guān)系

3 討論

Ang-2位于人類染色體的8p23.1，其受體為Tie-2，該受體的磷酸化參與血管生成的延續(xù)過(guò)程，使血管成熟穩(wěn)定。有研究[6]表明Ang-2的表達(dá)是腫瘤性血管新生起始的強(qiáng)化因素，與腫瘤性血管生成的數(shù)目和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Ang-2與Tie-2受體特異性地結(jié)合，可拮抗Ang-1穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)的作用，消除血管基底膜和周圍間質(zhì)細(xì)胞對(duì)血管形成的限制，并增加內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等血管增殖因素的敏感性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、萌芽、遷移，從而促進(jìn)血管生成，血管增生顯著，管壁通透性明顯增加，繼而導(dǎo)致了高度不穩(wěn)定滲漏性、不成熟性及內(nèi)皮細(xì)胞高度增殖的腫瘤血管持續(xù)生成[7]。研究[8]表明，Ang-2是一個(gè)獨(dú)立的指標(biāo)，可用于臨床評(píng)價(jià)肝細(xì)胞癌患者的病情，與腫瘤大小和患者的生存密切相關(guān)。有研究[9-12]發(fā)現(xiàn)，Ang-2過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致肺腫瘤不受控制的轉(zhuǎn)移；抑制Ang-2則可減少腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和自發(fā)性腫瘤的發(fā)生；Ang-2是非常有希望的腫瘤治療靶點(diǎn)。

K-ras基因突變點(diǎn)固定在12、13和61密碼子，其中以12位密碼子突變最常見(jiàn)。作為一種原癌基因，K-ras基因突變?cè)诮Y(jié)直腸細(xì)胞癌變的早期即被啟動(dòng)，突變產(chǎn)生具有致癌活性的P21蛋白，通過(guò)Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活下游信號(hào)分子，持續(xù)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖，引起細(xì)胞惡變。K-ras基因的激活有多種表現(xiàn)形式，可以是表達(dá)增加或是基因突變或是內(nèi)在的GTP酶活性下降。

該研究結(jié)果顯示：結(jié)直腸癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，兩者的表達(dá)量呈線性正相關(guān)，且兩者表達(dá)量與腫瘤的浸潤(rùn)深度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度有關(guān)，與Goede等[13]研究結(jié)果相同。研究結(jié)果還顯示，40例結(jié)直腸癌組織中K-ras基因突變率為42.5%，K-ras基因突變與性別、腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)深度等無(wú)明顯相關(guān)，但有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者K-ras基因突變率高于無(wú)轉(zhuǎn)移者，Dukes分期C、D期者K-ras基因突變率高于A、B期。作者還發(fā)現(xiàn)，K-ras基因突變的結(jié)直腸癌組織中Ang-2、Tie-2 mRNA表達(dá)量高于無(wú)突變者，提示K-ras基因突變可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管的生成，參與了結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。

總之，Ang-2、Tie-2系統(tǒng)在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制和未來(lái)的治療靶點(diǎn)方面值得進(jìn)一步研究；K-ras基因作為分子生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)判斷結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后具有重要意義。

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