miR-106b對HeLa細胞順鉑化療敏感性的影響*

饒玉梅，陳 剛，李留霞，李秀芳，余靜麗

1)鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州 450052 2)華中科技大學附屬同濟醫院婦產科 武漢 430030

以鉑類為基礎的化療在宮頸癌的臨床治療中應用廣泛，然而其化療耐藥仍是臨床中急需解決的問題之一[1]。腫瘤化療耐藥涉及藥物在體內及細胞內的轉運、代謝、細胞的損傷與修復等多個方面。microRNA是一種只有21～25個堿基的非編碼小RNA，廣泛存在于自然界中，研究[2]顯示其在多數人類惡性腫瘤中表達失調，參與細胞的增殖、分化和凋亡等的調節，也參與腫瘤細胞的化療耐藥。有報道[3-4]miR-106b在小細胞肺癌、前列腺癌等高表達，并影響它們的轉移侵襲功能，而有關其對化療耐藥影響的報道較少，僅見其對睪丸癌順鉑(DDP)耐藥影響的報道[5]。有研究[6]報道miR-106b在宮頸癌組織中高表達，但其對宮頸癌生物學行為的影響未見報道，為此，作者進行了如下研究，探討miR-106b對宮頸癌HeLa細胞的DDP化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1材料宮頸癌HeLa細胞(美國ATTC公司)，DMEM培養基(美國 Gibco公司)，小牛血清、脂質體2000(美國Life Technologies公司)，DDP、MTT(美國 Sigma 公司)，miR-106b抑制劑、miR-106b類似物及其相應的陰性對照(美國Dharmacon公司)，Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，miR-106b逆轉錄引物及實時定量PCR擴增引物、反轉錄試劑盒、TaqMan MicroRNA試劑盒、U6 snRNA (廣州市銳博生物科技有限公司)。

1.2miR-106b抑制劑、類似物轉染后HeLa細胞中miR-106b的表達將處于對數生長期的HeLa細胞接種于6孔板中。按照脂質體2000說明書進行陰性對照(抑制劑陰性對照組、類似物陰性對照組)，miR-106b抑制劑，miR-106b類似物的轉染，并設置空白對照。轉染6 h后換新培養基，繼續培養24 h，用于后續實驗。按照Trizol說明書抽提總RNA，應用反轉錄試劑盒，將總RNA反轉錄成cDNA，應用TaqMan MicroRNA試劑盒對合成的cDNA進行實時定量PCR反應，反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 15 s，40循環；以U6為內參照，每組設3個復孔。

1.3miR-106b抑制劑、類似物轉染后細胞對不同濃度DDP敏感性的MTT法檢測細胞培養及分組同1.2。將轉染后的HeLa細胞以5×103個細胞/孔接種于96孔培養板中。24 h后加入濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0和15.0 μmol/L的DDP，每個濃度設3個復孔，培養48 h后加入MTT溶液(5 g/L)15 μL，繼續培養4 h，棄上清，加入100 μL DMSO后振蕩20 min，在酶聯免疫檢測儀上測定570 nm波長時各孔光密度值(D)。細胞存活率=D(實驗孔)/D(未加DDP對照孔)×100%。

1.4細胞凋亡率的流式細胞儀檢測細胞培養及分組同1.2。依據MTT的結果，選取10 μmol/L DDP作用于各組細胞，然后常規收集細胞，PBS洗1次，按照Annexin-PI凋亡檢測試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.5細胞中目的蛋白表達的Westernblot檢測收獲對數生長期空白對照、轉染miR-106b抑制劑、類似物及陰性對照的細胞，加入100 μL預冷的細胞裂解液30 min，10 000g4 ℃下離心收集上清，二喹啉甲酸法測定提取蛋白的濃度。取100 μg總蛋白進行電泳，電轉儀轉至PVDF膜上；37 ℃、50 g/L脫脂奶封閉1 h，加入Twist1(1100稀釋)、PTEN(11 000稀釋)、p-AKT(Ser473) (11 000稀釋)、β-actin(11 000稀釋)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入相應的堿性磷酸酶標記的二抗，常溫孵育1 h，最后NBT/BCIP顯色拍照。以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達量。

1.6統計學處理采用SPSS 13.0進行數據分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組細胞中miR-106b表達、細胞存活率、凋亡率以及Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組HeLa細胞中miR-106b的表達結果見表1。

表1 miR-106b抑制劑、類似物轉染后各組細胞中miR-106b的表達

F=5 308.285，P<0.001；*：與相應的陰性對照組及空白對照組相比，P<0.05。

2.2不同濃度DDP作用48h后各組細胞存活率的變化見表2。與對照組相比，不同濃度DDP作用下，轉染miR-106b抑制劑后HeLa細胞的存活率下降，而轉染miR-106b類似物后HeLa細胞的存活率明顯上升。

2.3 10μmol/LDDP作用下各組細胞凋亡率的比較見表3。與對照組相比，miR-106b抑制劑可以促進細胞凋亡，miR-106b類似物可以抑制細胞凋亡。

2.4各組細胞中Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)蛋白的表達見圖1、表4。轉染miR-106b抑制劑后細胞中PTEN蛋白表達升高，Twist1、p-AKT蛋白表達降低；轉染miR-106b類似物后PTEN蛋白表達降低，Twist1、p-AKT蛋白表達增強。

表2 不同濃度DDP作用48 h后各組細胞存活率的變化 (n=3) %

*：與相應的陰性對照組及空白對照組相比，P<0.05。

表3 10 μmol/L DDP作用下各組凋亡率的比較 %

F=70.807，P<0.001；*：與相應的陰性對照組及空白對照組相比，P<0.05。

表4 各組細胞中PTEN、Twist1、p-AKT(Ser473)蛋白的表達 (n=3)

*:與相應的陰性對照組及空白對照組相比，P<0.05。

圖1 各組細胞中PTEN、Twist1、p-AKT(Ser473)蛋白的表達

3 討論

miR-106b的編碼基因定位于染色體7q22.1，其在宮頸癌組織中高表達[6]，且其表達還受人乳頭瘤狀病毒(HPV)的E6、E7蛋白的調節[7]，而HPV是宮頸癌的致病因素[8]，因此推測其在宮頸癌的發生發展中發揮重要作用。作者將miR-106b的抑制劑及類似物轉染HeLa細胞，MTT實驗顯示，當抑制miR-106b表達時，HeLa細胞對DDP的敏感性增強；而過表達miR-106b時，HeLa細胞對DDP的敏感性下降；凋亡檢測也顯示了同樣的結果。

有資料[9]顯示，miR-106b通過調節TGF-β信號通路而發揮作用。作者的研究結果顯示miR-106b可以影響Twist1、PTEN、p-AKT(Ser473)蛋白的表達。PTEN是一種很重要的抑癌基因，其可影響到腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移侵襲等多方面的功能[10]。當降低miR-106b的表達，可增強PTEN表達，降低p-AKT的表達；當增強miR-106b的表達時，得到相反的效果。因此作者推測，miR-106b可能通過影響PTEN/AKT信號通路，進而影響HeLa細胞對DDP的敏感性。

盡管Twist1是細胞上皮間充質轉化的一個重要的特征分子，在腫瘤細胞侵襲轉移中得到廣泛的研究，但另有報道[11]顯示，Twist1也影響骨肉瘤細胞對DDP的化療敏感性，當增強Twist1的表達，骨肉瘤細胞對DDP的敏感性下降。作者的研究顯示，當增強miR-106b的表達時，Twist1的表達增強；而降低miR-106b的表達時，得到相反的效果。作者的研究結果還顯示增強miR-106b表達，HeLa細胞對DDP的敏感性下降；降低miR-106b表達可增強HeLa細胞對DDP的敏感性。因此作者推測，miR-106b可能通過改變Twist1的表達，影響HeLa細胞對DDP的敏感性。這為miR-106b調控腫瘤細胞對DDP的敏感性的機制研究提供了一個全新的觀點。

綜上所述，miR-106b在宮頸癌HeLa細胞中高表達，其可能通過影響PTEN/AKT信號通路及Twist1的表達來調節HeLa細胞對DDP的敏感性。當然，以上實驗均為體外實驗，其最終需要體內實驗進一步驗證。鑒于miRNA上、下游調控分子的網絡化、復雜化，miR-106b上游及下游調控分子的研究將是今后作者進一步研究的重點。

[1]Smith B, Cohn DE, Clements A, et al. Is the progression free survival advantage of concurrent gemcitabine plus cisplatin and radiation followed by adjuvant gemcitabine and cisplatin in patients with advanced cervical cancer worth the additional cost? A cost-effectiveness analysis[J]. Gynecol Oncol，2013 May 26.[Epub ahead of print]

[2]Cortes-Sempere M, Ibanez de Caceres I. microRNAs as novel epigenetic biomarkers for human cancer[J]. Clin Transl Oncol, 2011, 13(6): 357

[3]Savita U, Karunagaran D. MicroRNA-106b-25 cluster targets beta-TRCP2, increases the expression of Snail and enhances cell migration and invasion in H1299 (non small cell lung cancer) cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 434(4): 841

[4]Hudson RS, Yi M, Esposito D, et al. MicroRNA-106b-25 cluster expression is associated with early disease recurrence and targets caspase-7 and focal adhesion in human prostate cancer[J]. Oncogene, 2012 Sep 17.[Epub ahead of print]

[5]Koster R, di Pietro A, Timmer-Bosscha H, et al. Cytoplasmic p21 expression levels determine cisplatin resistance in human testicular cancer[J]. J Clin Invest, 2010, 120(10): 3594

[6]Ma D, Zhang YY, Guo YL, et al. Profiling of microRNA-mRNA reveals roles of microRNAs in cervical cancer[J]. Chin Med J (Engl), 2012, 125(23): 4270

[7]Zheng ZM, Wang X. Regulation of cellular miRNA expression by human papillomaviruses[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1809(11/12): 668

[8]劉潔,平靜,常正義,等.DNA定量分析及HR-HPV檢測在宮頸病變篩查中的價值[J]. 鄭州大學學報：醫學版，2012, 47(3):356

[9]Smith AL, Iwanaga R, Drasin DJ, et al. The miR-106b-25 cluster targets Smad7, activates TGF-beta signaling, and induces EMT and tumor initiating cell characteristics downstream of Six1 in human breast cancer[J]. Oncogene, 2012, 31(50): 5162

[10]黃麗艷，王娜，湯黎明，等.PTEN基因表達對EC9706細胞增殖、侵襲、凋亡能力的影響[J]. 鄭州大學學報：醫學版，2013,48(1):16

[11]Zhou Y,Zang X,Huang Z,et al.TWIST interacts with endothelin-1/endothelin A receptor signaling in osteosarcoma cell survival against cisplatin[J].Oncol Lett,2013,5(3):857