瑞舒伐他汀對大鼠急性心肌梗死后梗死組織miR-126的表達及血管再生的影響

孫 濤，萬大國，宋恒良，孫慎杰

鄭州大學第二附屬醫院心內科 鄭州 450014

心肌梗死發病的主要機制是心肌缺血，心肌血運重建術已經成為治療心肌梗死的主要方法。血管生成是一個受多種信號分子和通路精確調控的復雜過程，在多種促血管生成細胞因子的誘導下，內皮細胞、血管平滑肌細胞和成纖維細胞經過活化、遷移、增殖，逐步裝配形成管腔。miRNA在許多生物學過程如細胞增殖、分化、凋亡、癌癥發生中發揮重要的調控作用。最近研究[1]表明，miRNA也參與調控心血管系統的發育和疾病發生過程。新生血管形成是心肌梗死后心臟修復的必經環節。miR-126位于內皮細胞特異表達基因 egfl7的第 7 個內含子中，與egfl7共同轉錄；miR-126 通過抑制兩個血管新生的負調控因子Spred-1和 PI3KR的表達參與血管新生信號轉導，維持血管完整性[2]。他汀類藥物除具有降低血脂的作用外，在急性冠狀動脈綜合征患者中早期應用能夠抑制血管內皮的炎癥反應，穩定粥樣斑塊，改善血管內皮功能，具有延緩動脈粥樣硬化(AS)程度、抗炎、保護神經和抗血栓等作用[3]。作者觀察了瑞舒伐他汀對大鼠心肌梗死后梗死組織miR-126的表達和微血管密度(MVD)的影響，探討其與血管再生的關系。

1 材料與方法

1.1材料Trizol購自Invitrogen公司，LA Taq酶、has-miR-126定量PCR檢測試劑盒均購自Transgene公司，其他試劑均為國產試劑。80只清潔級成年SD健康大鼠購自鄭州大學實驗動物中心，合格證號為SCXK(豫)：2011-0005；雌雄不拘，2～3月齡，體質量225～350 g。

1.2實驗分組參照文獻[4-5]的方法，縫扎大鼠左前降支動脈建立急性心肌梗死模型，有62只大鼠存活，術后24 h采用隨機數字表法分為2組，每組31只。次日起瑞舒伐他汀組給予瑞舒伐他汀10 mg/(kg·d)連續灌胃6周，模型組給予等量助溶溶劑連續灌胃6周。6周中2組各有4只動物死亡，6周后處死動物，取梗死部位心肌組織標本。

1.3MVD檢測參照文獻[6]方法計數微血管。組織標本以體積分數10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片。采用免疫組化SP法染色，具體方法參照試劑盒(北京北瑞達醫藥科技有限公司)說明書進行。高倍鏡下計數微血管數(Ⅷ因子相關抗原vWF多克隆抗體標記)。記錄5個熱點微血管數，取均數為最終MVD值。

1.4miR-126表達水平的測定采用實時熒光定量PCR法。使用Trizol常規方法提取組織標本RNA，經測定完整性和純度后用于實驗。依據武漢中幟生物科技有限公司提供的方法進行引物設計，莖環引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TCGCACTGGATACGACCGCATT，上游引物：5’-GGCTCGTACCGTGAGTAAT-3’，下游引物：5’-GTG CAGGGTCCGAGGT-3’，擴增產物長度462 bp。擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環；72 ℃延伸6 min。實時熒光定量PCR等操作按試劑盒說明進行，采用U6作參考基因，計算表達量。

1.5統計學處理應用SPSS 18.0處理數據。采用兩獨立樣本的t檢驗比較2組大鼠心肌梗死組織MVD和miR-126的表達量；采用線性相關分析探討瑞舒伐他汀組大鼠心肌梗死組織2指標的關系。 檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組大鼠心肌梗死組織MVD和miR-126表達水平的比較見表1。

表1 2組大鼠心肌梗死組織MVD和miR-126表達水平的比較

2.2瑞舒伐他汀組大鼠MVD和miR-126表達水平的相關性瑞舒伐他汀組大鼠心肌梗死組織MVD和miR-126的表達水平呈正相關(r=0.720,P=0.026)。

3 討論

他汀類藥物是一種3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是目前臨床上廣泛應用的調整脂代謝紊亂的藥物。Colakoglu和Elewa等[7-8]的研究顯示，臨床常規劑量的他汀藥對缺血誘導的血管新生表現為促進作用，其機制可能與PI3K/Akt通路有關。張月蘭等[9]研究發現，給予匹他伐他汀治療14 d后，大鼠缺血后肢新生血管密度較對照組顯著升高。Kikuchi等[10]發現匹他伐他汀可以通過影響Notch1的表達促進血管新生。Ma等[11]還發現他汀類藥物對血管新生的影響還具有組織特異性。王東偉等[12]還發現大劑量瑞舒伐他汀可控制炎癥反應。

已知miRNA在心血管系統中高度表達和特異表達，其在冠心病的發病和治療中起重要作用。miR-126也是最新發現的促進心肌梗死后血管再生的小分子RNA。在哺乳動物，miR-126起源于egfl-7基因的前體結構，miR-126和其宿主基因egfl-7的轉錄被轉錄因子Ets1調控[13]。egfl-7是一種分泌蛋白，調控新生血管內皮芽細胞的移動和定位。Harris等[14]首次闡述了miR-126主要在內皮細胞中表達，在肺、心臟和肝臟等血管高度豐富的組織中，miR-126的表達水平也很高。各種各樣的血管生長因子如VEGF或FGF對于梗死后的血管生成起到一定的作用。miR-126作用于VEGF和FGF，增強了血管生成前的反應，通過抑制Spred-1(一種Ras/MAP激酶信號通路的細胞內抑制劑)的表達促進血管的生成[15]。該研究結果顯示，瑞舒伐他汀能促進心肌梗死后梗死組織血管再生，上調miR-126的表達，且血管再生和miR-126的表達呈正相關，提示瑞舒伐他汀可能通過上調miR-126的表達促進心肌梗死大鼠梗死心肌組織的血管再生。

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