Plk1磷酸化修飾PinX1對宮頸癌HeLa細胞有絲分裂及凋亡的影響*

王 沖，余 建，黃 河#

1) 鄭州大學第一附屬醫院血液科 鄭州 450052 2) 浙江大學附屬第一醫院骨髓移植中心 杭州 310003

PinX1最初是作為一個新的端粒結合蛋白(telomeric repeat binding protein,TRF)，由Zhou等[1]在2001年以酵母雙雜交的方法首先鑒定出來。PinX1由328個氨基酸組成，其中有2個特殊的結構域：經常出現在RNA結合蛋白中的G-patch結構域和端粒酶抑制結構域。PinX1是迄今發現的對端粒酶活性具有最強抑制作用的蛋白質，抑制PinX1的功能則會促進端粒酶活性進而延長端粒。作者的前期研究[2]發現：有絲分裂前期，PinX1定位于染色體周邊以及動點外層；而在有絲分裂期，siRNA抑制PinX1蛋白的表達導致染色體滯后出現[2]。但PinX1通過何種機制參與細胞周期的調控尚不清楚。作者運用酵母雙雜交、免疫共沉淀、谷胱甘肽-S轉移酶(glutathione S-transferase，GST)沉降實驗以及流式細胞術、免疫熒光染色分析等方法，初步探討有絲分裂激酶Plk1磷酸化修飾PinX1對細胞有絲分裂及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑人胚腎293T細胞株及人宮頸癌HeLa細胞株由浙江大學血液分子生物學實驗室保存；胎牛血清購自Hyclone公司；青、鏈霉素和DMEM培養基購自Invitrogen公司；胰蛋白酶購自華美(SABC)公司；Nocodazole、GW843683X、G418購自Sigma公司。

質粒：含有Flag標記的PinX1真核表達質粒由哈佛大學Kunping Lu教授惠贈。BD-PinX1、Flag-PinX1、GST-PinX1、GFP-PinX1及GST-PinX1截短突變質粒均通過PCR擴增PinX1片段，分別插入pGBKT7、p3XFLAG-myc-CMVTM-24、pEGFP-C2、pGEX-5X-3質粒載體構建而成；Flag-Plk1、GST-Plk1、AD-Plk1質粒通過PCR擴增的Plk1片段插入p3XFLAG-myc-CMVTM-24、pGEX-5X-3、pGADT7質粒構建而成。所有質粒均經測序證實。

抗體：鼠抗Myc單克隆抗體9B11、鼠抗GFP單克隆抗體、鼠抗HA單克隆抗體購自Cell Signaling公司；鼠抗Flag單克隆抗體M2、鼠抗α-tubulin單克隆抗體購自Sigma-Aldrich公司；鼠抗PinX1單克隆抗體購自Abnova公司；鼠抗Plk1單克隆抗體、鼠抗磷酸化絲氨酸單克隆抗體購自Abcam公司；羅丹明偶聯羊抗鼠IgG抗體購自Jackson Immunoresearch公司。

其他材料：AH109酵母菌種、DH5α及BL21大腸桿菌菌種由浙江大學血液分子生物學實驗室保存；人睪丸cDNA文庫、casein蛋白和MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3試劑盒購自Clontech公司；限制性內切酶EcoRⅠ、SalⅠ、T4 DNA連接酶及相關緩沖液購自TaKaRa公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

1.2Plk1與PinX1結合的檢測

1.2.1 酵母雙雜交實驗 按照Clontech公司酵母雙雜交操作手冊進行。酵母雙雜交實驗共分為4組進行，陰性對照組(pGBKT7-Lam+pGADT7-T)，陽性對照組(pGBKT7-P53+pGADT7-T)，實驗組(pGBKT7-PinX1+pGADT7-Plk1)，已知陽性結果組(pGBKT7-TRF1+pGADT7-Plk1),分別將上述各組的質粒共轉染進入AH109感受態酵母菌，涂于SD/-Trp/-Leu及SDP/-Ade/-Trp/-His，30 ℃培養至陽性菌落出現，再將菌落劃線至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培養板培養至藍色菌落出現。

1.2.2 重組載體轉染細胞 轉染方法參照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行操作。將HeLa細胞株培養至對數生長期，轉染前24 h，胰酶消化細胞并接種于6孔板，每孔5×105個細胞，取相應真核表達質粒及其空白對照質粒轉染細胞。

1.2.3 免疫共沉淀實驗 收集HeLa細胞，加入RIPA緩沖液進行裂解；將細胞裂解液或正常鼠血清(對照)與蛋白A和蛋白G瓊脂凝膠珠共孵育后，加入1 μg鼠抗PinX1單克隆抗體，旋轉搖床上4 ℃旋轉過夜孵育以捕獲目的蛋白。蛋白裂解物及免疫沉淀復合物用上樣緩沖液加熱變性，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉移至硝酸纖維素膜上，以相關抗體檢測蛋白，再以相應第二抗體孵育后，用ECL發光底物壓片顯影。

1.2.4 GST融合蛋白純化 參照GST結合蛋白純化說明書進行操作。純化出的谷胱甘肽瓊脂糖珠融合蛋白質行SDS-PAGE電泳，以考馬斯亮藍R-250染色檢驗，將純化的蛋白質4 ℃保存。

1.2.5 GST體外沉降實驗 共分為3組進行檢測，內參對照組，GST對照蛋白組和GST-PinX1融合蛋白組。HeLa細胞裂解液經RIPA緩沖液預清除后，首先取20 μL裂解液作為內參對照，再分別與GST對照蛋白和GST-PinX1融合蛋白共同孵育，隨后以SDS-PAGE電泳分離產物后，進行免疫印跡分析。

1.3Plk1體內外磷酸化修飾PinX1實驗

1.3.1 體外磷酸化實驗 分為4組進行檢測，casein陽性對照組，GST對照蛋白組，GST-PinX1融合蛋白組，GST-PinX1 5A突變體融合蛋白組。分別在各組蛋白中加入10×磷酸化buffer 3 μL，2 pmol/L的ATP 1 μL，Plk1蛋白激酶1 μL，γ-32P-ATP 0.5 μL，目的蛋白2 μg，加水補足到30 μL，30 ℃水浴45 min。反應結束后，加入20 μL PBS 和4 μL 6×SDS加樣緩沖液，行SDS-PAGE電泳，以考馬斯亮藍R-250染色，制作干膠后進行放射自顯影。

1.3.2 體內磷酸化實驗 將Flag-PinX1真核表達質粒轉染293T細胞，以100 nmol/L Nocodazole處理18 h，收集細胞前，再分別加入1 μmol/L DMSO(對照組)或者Plk1特異性小分子抑制劑GW843682X(實驗組)處理8 h，收集細胞進行免疫共沉淀實驗。

1.4Plk1磷酸化PinX1對細胞有絲分裂影響的檢測采用免疫熒光染色分析。以相應真核表達質粒(GFP-PinX1、GFP-PinX1 5A及GFP-PinX1 5D)轉染HeLa細胞24 h后，用甲醛溶液固定細胞，TBST緩沖液室溫下封閉30 min。用一抗和二抗室溫下孵育1 h，TBST緩沖液清洗后，以適量DAPI染色細胞，滴加抗淬滅劑并封片。用Zeiss Axiovert 200熒光倒置顯微鏡進行免疫熒光染色檢測。

1.5Plk1磷酸化PinX1對細胞凋亡的影響分別收集轉染GFP、GFP-PinX1、GFP-PinX1 5A和GFP-PinX1 5D質粒的HeLa細胞，4 ℃條件下用體積分數為70%的冰乙醇固定30 min，15 000 r/min離心30 s。細胞重懸于PBS中，以碘化丙啶4 ℃避光染色1 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0 進行數據分析。轉染不同質粒的HeLa細胞凋亡率的比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1Plk1與PinX1結合情況

2.1.1 酵母雙雜交結果 共轉pGADT7-Plk1與pGBKT7-PinX1的AH109菌株在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal培養板能夠生長并激活報告基因(圖1)，表明Plk1可能是一個新的PinX1結合蛋白。

2.1.2 免疫共沉淀結果 在HeLa細胞株中，內源性Plk1能夠與PinX1抗體發生共沉淀反應，形成復合物，而與對照血清無結合(圖2)，表明Plk1與PinX1可能在細胞內相互結合。

2.1.3 GST沉降實驗結果 GST-PinX1能夠與內源性Plk1相結合，形成復合物，而空GST蛋白則不能將Plk1沉淀下來(圖3)，提示PinX1與Plk1能夠在體外相互結合。

圖1 Plk1與PinX1結合的酵母雙雜交結果

圖2 Plk1與PinX1結合的免疫共沉淀結果

圖3 GST沉降實驗結果

2.2Plk1體內外磷酸化修飾PinX1情況

2.2.1 體外磷酸化實驗結果 Plk1能夠在體外磷酸化GST-PinX1，而不能磷酸化GST-PinX1 5A以及GST對照蛋白(圖4)。

2.2.2 體內磷酸化實驗結果 加入GW843682X處理后，磷酸化PinX1條帶明顯減弱(圖5)。表明Plk1能夠在體內磷酸化修飾PinX1。

2.3Plk1磷酸化PinX1對細胞有絲分裂的影響

免疫熒光染色分析結果顯示過量表達PinX1非磷酸化突變體會導致明顯的染色體排列異常，而過量表達PinX1野生型及模擬磷酸化突變體則不明顯(圖6)。

圖4 Plk1體外磷酸化修飾PinX1情況

圖5 Plk1體內磷酸化修飾PinX1情況

圖6 Plk1磷酸化PinX1對細胞染色體的影響

2.4Plk1磷酸化修飾PinX1對HeLa細胞凋亡的影響轉染了GFP、GFP-PinX1、GFP-PinX1 5A及GFP-PinX1 5D的HeLa細胞的凋亡率分別為(4.63±0.25)%、(8.00±0.70)%、(45.30±1.45)%和(8.83±0.45)%，4者比較差異有統計學意義(F=76 554.133,P<0.001)。表達PinX1非磷酸化突變體的HeLa細胞的凋亡明顯增加。

3 討論

端粒酶在腫瘤細胞永生化過程中起到重要作用[3]。端粒酶活性受到多種蛋白質的調控，這些蛋白質通過相互作用影響端粒酶全酶的組裝和去組裝，使其空間構象發生改變，或使其與端粒序列的結合能力改變，從而影響端粒酶的功能或直接抑制端粒酶活性[4-5]。PinX1是一個經典的端粒相關蛋白質，除了能夠與端粒結合蛋白TRF1相互作用之外，還能與hTERT和hTR在體內形成復合物[6]。PinX1還是迄今發現的對端粒酶活性具有最強抑制作用的蛋白質。外源性PinX1過量表達能強力抑制端粒酶活性，從而導致端粒縮短；而當敲除內源性PinX1后，端粒酶活性升高，端粒長度增加。除了在端粒長度調控方面發揮重要功能之外，已有研究[7]表明：PinX1在實體腫瘤中的表達與腫瘤進展及預后高度相關[7]；在裸鼠中，PinX1的缺失有促進腫瘤發生的作用[8-9]。近來亦有報道[2,10]表明PinX1也可能參與了細胞周期的調控。因此，PinX1有可能是一個潛在的聯系端粒和細胞有絲分裂的信號分子，也是一個很有希望的抗腫瘤藥作用靶點。

在該項研究中，作者采用酵母雙雜交的方法，成功鑒定出Plk1是一個新的PinX1結合蛋白。Plk1能夠與PinX1在體內體外相互結合，Plk1能夠在有絲分裂期磷酸化修飾PinX1。免疫熒光染色結果顯示：PinX1的非磷酸化突變體能夠導致細胞出現大量異常排列染色體，而野生型和模擬磷酸化突變體則沒有此等表現。這充分說明，Plk1對PinX1的磷酸化修飾對保證細胞染色體的正常分離是必需的。這些結果提示：在尋找細胞端粒和有絲分裂的功能鏈接點方面，PinX1有可能是一個新的突破口。同時，過量表達PinX1非磷酸化突變體會導致明顯的細胞凋亡增加，表明Plk1可能通過磷酸化PinX1參與了細胞凋亡的調控，這也為進一步研究Plk1對細胞周期和凋亡調控的影響提供了新的實驗證據。

綜上所述，該研究證明了Plk1能夠磷酸化并調控PinX1；PinX1的非磷酸化突變體能導致細胞染色體分離出現異常及細胞凋亡的增加。選擇PinX1作為基因治療的靶點，可能會為腫瘤的靶向治療提供新的線索。

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