柯薩奇病毒B5巢式RT-PCR檢測方法的建立*

段晶晶，劉國華，黃學勇，李幸樂，王 芳，胡小寧1,，許汴利1,#

1) 鄭州大學公共衛生學院流行病學教研室 鄭州 450001 2)鄭州市疾病預防控制中心傳染病防治科 鄭州 450007 3) 河南省疾病預防控制中心傳染病預防控制所 鄭州 450016 4)鄭州市兒童醫院感染性疾病科 鄭州 450053

近年來，河南省暴發多起病毒性腦炎，經檢測主要由柯薩奇病毒B5(coxsackie virus B5, CVB5)引起[1]。CVB5是一種常見的能引起病毒性腦炎的腸道病毒，屬于腸道病毒屬小核糖核酸病毒，無包膜，單股正鏈RNA[2]，其引起的病毒性腦炎在我國廣泛存在[3-4]。病毒的分離培養與PCR擴增測序是鑒定CVB5的主要方法和金標準，但由于該方法的敏感性和檢出率低、耗時長且費用高，臨床上極少采用[5]，探索簡單、快速、靈敏度高的CVB5檢測方法非常有必要，為此，作者建立了檢測CVB5的巢式RT-PCR方法，報道如下。

1 材料與方法

1.1毒株、試劑與儀器CVB5、Echo6、Echo25、EV71、CVA16毒株由河南省疾病預防控制中心傳染病所實驗室分離培養和保存。52份(血清16份，糞便19份，腦脊液17份)樣本采自臨床確診的病毒性腦炎病例。RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)；RT-PCR試劑盒和PCR反應液(TaKaRa公司)，PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀(BIO-RAD公司)。

1.2引物設計與合成從GenBank下載CVB5河南分離株全基因序列，進行保守性分析，根據引物設計原則，在VP1區設計巢式PCR引物，包括外引物P1：5’-GTGGAGAGGGCCATTGCACGCGTCG-3’，P2：5’-CAGTCACGCCAGTAGGTTCAAAAT-3’，預期擴增產物大小約800 bp；內引物P3：5’-TATGATGGGT GGGCTAGGTT-3’，P4：5’-TCTGTCACGCCAGTAGGT TC-3’，預期擴增產物大小約200 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3標本RNA的提取與反轉錄按照RNA提取試劑盒說明書的操作步驟提取所有樣本RNA后，在Microtube管中加入dNTP Mixture和Random 6 mers各1 μL，已提取的RNA 2 μL，再加入RNase Free dH2O至終反應體系為10 μL， PCR儀上65 ℃ 5 min進行變性、退火。產物離心數秒后在該EP管中加入Prime ScriptTMBuffer 4 μL，RNase Inhibitor和Prime ScriptTMRTase各0.5 μL，RNase Free dH2O 5 μL，配置成20 μL反應體系。反轉錄PCR反應條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。

1.4巢式PCR反應條件的優化PCR反應總體系為50 μL，每次反應保持其他3個條件不變，分別以cDNA 模板梯度0.5、1.0、1.5、2.0 μL，上下游引物(25 μmol/L)梯度0.4、0.8、1.0、1.2、1.6 μL，退火溫度梯度50 ℃、53 ℃、56 ℃、59 ℃、62 ℃，循環數20、25、30、35個梯度循環進行PCR反應，將產物進行瓊脂糖凝膠電泳后觀察成像結果，確定最適模板量、最佳引物量、最適退火溫度和最佳循環數。

1.5產物的檢測和鑒定取PCR反應產物8 μL，用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳(180 V，30 min)。根據DNA Marker(DL2000)、陽性對照和陰性對照判定結果，使用凝膠成像系統記錄結果。PCR反應結果為陽性者委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序，用Blast程序進行同源性鑒定。

1.6巢式RT-PCR的評價及臨床應用①特異性：選用已經過鑒定的5株不同的CVB5毒株和4株其他腸道病毒毒株(包括Echo6、Echo25、EV71、CVA16)及陰性對照(H2O)，用所建立的方法進行擴增，以驗證該方法的特異性。②敏感性：選用RD細胞進行病毒效價滴定，得到CVB5標準株病毒濃度為6.32×107TCID50mL-1后，以其為標準進行10倍連續稀釋，分別得到1 000 TCID50，100 TCID50，10 TCID50，1 TCID50，10-1～10-9TCID50，用已建立的方法進行擴增，取產物8 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，以確定其敏感性。③重復性：將CVB5、Echo25、EV71等不同毒株及10份病毒性腦炎病例樣本分別用已建立的檢測方法重復實驗3次,以判斷其重復性。對52個臨床標本進行檢測時，分別以CVB5標準株和無菌水作為陽性和陰性對照。

2 結果

2.1巢式RT-PCR反應體系和反應條件優化結果

最終確定2輪PCR擴增反應總體系均為50 μL，包括PCR反應液25 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、RNase Free dH2O 22 μL。在第2輪擴增反應中，取第1輪PCR擴增產物1 μL作為第2輪的反應模板。反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min。第2輪反應條件除了將第1輪的30個循環改為25個循環外，其他與第1輪相同。

2.2擴增產物的鑒定CVB5經2輪擴增，結果顯示第1輪擴增產物位于800 bp條帶處，第2輪擴增產物位于200 bp條帶處，且第2輪與第1輪相比條帶更加清晰，見圖1。測序及同源性分析結果顯示核苷酸同源性為100%，證明該擴增產物的確是CVB5的VP1區基因片段。

2.3巢式RT-PCR的特異性第1輪擴增，5株CVB5毒株均出現800 bp的目的條帶，且條帶清晰可見，無其他雜帶，而Echo6、Echo25、EV71、CVA16及陰性對照均無目的條帶，見圖2。第2輪擴增，5株CVB5毒株在200 bp處均出現目的條帶，而其余4株病毒及陰性對照未見目的條帶，見圖3。結果與預期一致，證明該方法對CVB5毒株具有高度特異性。

圖1 2輪PCR反應的電泳結果

圖2 特異性實驗第1輪擴增結果

圖3 特異性實驗第2輪擴增結果

2.4巢式RT-PCR的敏感性第1輪PCR反應的敏感性達到10 TCID50，見圖4。第2輪PCR反應敏感性達到10-4TCID50，見圖5。

2.5巢式RT-PCR的重復性分別用已建立的檢測方法對CVB5、Echo25、EV71等不同毒株及10份病毒性腦炎病例樣本重復測定3次，所有結果均一致。

2.6臨床樣品檢測結果對52份病毒性腦炎樣本用所建立的巢式RT-PCR方法進行擴增，其中有10份為陽性，陽性率為19.23%，分別為血清4份(4/16)、糞便3份(3/19)、腦脊液3份(3/17)，經測序鑒定全部為CVB5。而用病毒分離VP1測序方法得到陽性僅6份，分別為血清2份、糞便3份、腦脊液1份，且均來自于巢式RT-PCR結果為陽性的10份樣本。

圖4 靈敏性實驗第1輪擴增結果

圖5 靈敏性實驗第2輪擴增結果

3 討論

病毒性腦炎是常見的中樞神經系統感染性疾病，嚴重威脅兒童的身心健康，臨床上主要由醫生根據患兒的癥狀體征、腦脊液和腦電圖檢查等進行確診，但無法得到病原學診斷。病毒的分離培養是目前鑒定CVB5的金標準，但該方法存在操作繁瑣、耗費時間長、病毒分離成功率低等問題[6]。PCR作為一種新的分子生物學檢測技術，具有操作簡單、快速、靈敏度和特異度高、易標準化等特點，已被越來越多地用于腸道病毒的診斷[7]。該研究建立的巢式RT-PCR方法一般在5 h內即能完成包括RNA提取在內的CVB5的檢測，在采集當天即可以出結果，從而節約了大量的時間、人力和物力，降低了經濟成本。初步研究結果也顯示其特異性強，靈敏度達到10-4TCID50，且重復性好。用建立的巢式RT-PCR方法對臨床52份不同的病毒性腦炎樣本進行檢測，結果陽性的10份樣本經測序鑒定全部為CVB5，而病毒分離方法僅顯示6份陽性(均來自已檢測為陽性的10份樣本)，說明該方法較病毒分離方法具有更高的靈敏度。

綜上所述，該研究建立的巢式RT-PCR檢測方法具有簡單快速、靈敏度和特異度高、重復性好且經濟合理等特點，有效地解決了病毒分離方法存在的問題，為CVB5感染的流行病學調查和實驗室檢測提供了一種更為快速、敏感和可靠的手段。但由于CVB5是RNA病毒，核酸極易降解，同時PCR極易造成標本之間的污染，尤其是2次PCR反應，因此實驗操作中要保證標準的PCR操作環境和嚴格的實驗規程，以確保結果的準確性和可靠性。

[1] 黃學勇，許玉玲，李幸樂，等. 柯薩奇病毒B5河南分離株全基因組序列測定及分析[J]. 鄭州大學學報:醫學版,2011,46(6)：868

[2] 李華，楊卉娟，柯華昕，等.一株柯薩奇病毒B組5型(Cox.B5)病毒的分離及VP1基因分析[J].醫學研究雜志，2011,40(9)：55

[3] 胡永峰，趙麗娜，董杰，等．中國薩科奇病毒B5的全基因組測序及其序列分析[J].病毒學報，2010，26(4)：283

[4] 王海巖，李巖，徐愛強，等. 柯薩奇B5病毒引起山東省一起無菌性腦膜炎暴發的鑒定及其親緣進化分析[J].中華流行病學雜志，2010,31(1)：64

[5] 謝藝紅，董柏青.病毒性腦炎研究進展[J]. 應用預防醫學，2008,14(6)：382

[6] 沈建峰，蔣就喜. 病毒性腦炎的分子生物學診斷進展[J]. 醫學綜述，2010, 16(8)：1226

[7] Cheng MF, Chen BC, Huang TS, et al. Clinical application of reverse-transcription polymerase chain reaction and intravenous immunoglobulin for enterovirus encephalitis[J]. Jpn J Infect Dis, 2008，61(1)：18