抑制肝癌SMMC-7721細胞TWIST基因表達對細胞侵襲能力的影響

喬澤強

南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院普外一科 南陽 473058

肝癌細胞的侵襲轉移使其臨床進展迅速且預后較差，病死率高。研究肝癌細胞浸潤轉移的影響因素并闡明其機制，對于提高患者的生存率至關重要。已有研究[1-3]表明TWIST在乳癌、胃癌、結腸癌等組織中高表達且與腫瘤的侵襲轉移密切相關。作者設計合成了靶向TWIST基因的小干擾RNA，轉染入人肝癌SMMC-7721 細胞，采用RT-PCR和Western blot分析轉染細胞TWIST mRNA和蛋白表達水平，并觀察體外侵襲能力的變化。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑人肝癌 SMMC-7721 細胞株購自上海細胞生物研究所； 脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，RPMI 1640培養基(Gibco公司)，TWIST兔抗人多克隆抗體、E-cadherin兔抗人多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒及PCR擴增試劑盒(上海生工生物工程服務有限公司)，Boyden小室(鄭州金賽爾生物科技有限公司)，Matrigal膠(BD公司)。引物由北京賽百盛生物工程公司合成。

1.2靶向TWIST基因siRNA的合成根據相關文獻及查GenBank中TWIST基因(NM_000474.3)的序列，合成靶向TWIST的siRNA序列: 5’-UG GAUUUGUACCAUUCUUCUG-3’。用Blast對選中的特異性siRNA序列和無關序列進行同源性分析。同時設計陰性對照siRNA，其堿基序列隨機排列，與人類基因的外顯子無同源性。

1.3細胞分組SMMC-7721細胞在含100 g/L胎牛血清，1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基中于37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養。取對數生長期細胞接種于6孔板，每孔 2×105個，培養至細胞密度達50%，參照LipofectamineTM2000說明書轉染。實驗分為3組：空白對照組(未轉染)，陰性對照組(轉染陰性對照siRNA)，TWIST siRNA組(轉染靶向TWIST的siRNA)，濃度均為50 nmol/L。培養6 h后，轉為全培液培養，繼續培養48 h，收獲細胞，進行指標檢測。

1.4TWIST和E-cadherinmRNA的檢測采用半定量RT-PCR 方法。Trizol試劑提取細胞總RNA，電泳鑒定其完整性，逆轉錄得cDNA，PCR擴增TWIST和E-cadherin基因。TWIST引物上游序列：5’-TGGTCCATGTCCGCGTCCCA-3’，下游序列：5’-CGCCCCACGCCCTGTTTCTTT-3’，產物大小為207 bp；E-cadherin引物上游序列：5’-TGATTCTGCT GCTCTTGCTGTT-3’，下游序列：5’-CAAAGTCCTG GTCCTCTTCTCC-3’，產物大小為128 bp；內參β-actin引物上游序列：5’-GGGAAATCGTGCGTGACA-3’，下游序列：5’-TCAGGAGGAGCAATGATC-3’，產物大小為385 bp。使用SYNGENE凝膠分析系統軟件掃描，以目的基因條帶與內參基因條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的相對表達量。

1.5TWIST和E-cadherin蛋白的表達檢測采用Western blot方法。提取各組細胞總蛋白，用考馬斯亮藍G250結合法測定蛋白質濃度。各組樣品分別取總蛋白300 μg，經100 g/L SDS-PAGE電泳后轉PVDF膜。與特異性一抗37 ℃溫育2 h，4 ℃過夜。與二抗室溫孵育2 h后，ECL化學發光劑于暗室中曝光和顯影。測定目的條帶的光密度值，以其表示目的蛋白的相對表達量。

1.6細胞體外侵襲力采用Boyden小室檢測。小室上、下室之間用孔徑8 μm的聚碳酸酯膜分開，膜上鋪人工基底膜Matrigal 120 μL/室，下室加200 μL趨化因子，上室內滴入單細胞懸液(5×105L-1)400 μL/室，37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養24 h。取出小室，黏附到濾膜下室面的細胞用甲醛固定，常規HE染色，400倍顯微鏡下隨機計數5個視野穿膜細胞數。每組設3個平行樣本，重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 16.0進行數據處理，各組細胞TWIST、E-cadherin mRNA和蛋白表達，以及穿膜細胞數的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組細胞TWIST和E-cadherinmRNA的表達見圖1、表1。

圖1 各組細胞TWIST(上)和E-cadherin(下) mRNA的表達

2.2各組細胞TWIST和E-cadherin蛋白的表達

見圖2、表1。

2.3各組細胞體外侵襲能力的比較見表1。

圖2 各組細胞TWIST(上)和E-cadherin(下) 蛋白的表達

表1 各組細胞TWIST、E-cadherin mRNA和蛋白的表達以及穿膜細胞數比較

*與空白和陰性對照組比較，P<0.05。

3 討論

腫瘤侵襲轉移的過程涉及多種基因的表達異常，TWIST基因在其中的作用越來越受到重視[4]。TWIST是一種編碼位于常染色體上的堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子。TWIST基因最早于1983年在果蠅中被發現，隨后在多種生物及人體中也相繼發現了該基因的相似結構。TWIST核苷酸高度保守，在小鼠和人類的氨基酸序列具有96%的同源性，并且在不同的種屬中其DNA結合區域具有100%的序列保守[5]。Liu等[6]利用RNAi技術沉默MKN45細胞中TWIST基因的表達，發現MKN45細胞體外侵襲能力明顯下降；Gong等[7]研究發現在食管癌EC9706細胞中抑制TWIST基因的表達同樣可以抑制該細胞的體外侵襲能力。但有關TWIST基因在肝癌侵襲轉移中的作用研究較少。該研究結果表明，TWIST基因mRNA和蛋白的表達在TWIST siRNA組明顯低于空白和陰性對照組，TWIST siRNA組穿膜細胞數較空白和陰性對照組明顯減少， 提示沉默TWIST基因能有效降低SMMC-7721 細胞體外侵襲能力。

惡性腫瘤侵襲轉移是一個復雜的多步驟過程，但上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)在其中的起始作用越來越受到國內外學者重視[8]。跨膜蛋白E-cadherin是上皮表型的重要標志，它的表達降低是導致EMT發生至關重要的一步[9]。作者的研究結果顯示，TWIST siRNA組E-cadherin mRNA和蛋白的表達較空白和陰性對照組升高。因此推測TWIST可能作為E-cadherin的重要轉錄抑制因子，通過參與EMT的發生在肝癌的侵襲轉移中發揮重要作用。

綜上所述，抑制肝癌SMMC-7721細胞TWIST基因表達可能進一步抑制肝癌細胞EMT的發生，同時可有效降低肝癌細胞的侵襲轉移能力。下一步作者將進一步實驗印證TWIST和E-cadherin在肝癌發生發展中的作用，以期為肝癌的基因治療提供一定的理論基礎和可能的治療靶點。

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