侵襲性牙周炎患者牙齦組織中MMP-8及TIMP-1的表達(dá)*

岳新新，薛 蕊，張 煒，劉 娟，軒東英，章錦才，趙紅宇

1)南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院；廣東省口腔醫(yī)院牙周科 廣州 510280 2)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052 3)南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院；廣東省口腔醫(yī)院番禺分院牙周科 番禺 511400

牙周疾病是一種慢性炎癥導(dǎo)致的感染性疾病，其特點(diǎn)是牙周支持組織的喪失。侵襲性牙周炎(aggressive periodontitis, AgP)具有家族聚集性,發(fā)展迅速，是健康年輕患者失牙的主要原因之一。關(guān)于AgP的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚無明確定論，但大多數(shù)學(xué)者傾向于由微生物因素、宿主免疫因素及遺傳因素等多因素共同作用所致[1]。來源于宿主的基質(zhì)金屬蛋白酶-8(matrix metalloproteinase-8,MMP-8)，即膠原酶-2，是一種重要的膠原水解酶，在牙周結(jié)締組織和骨組織的破壞過程中起重要作用[2-3]。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)通常被認(rèn)為是MMPs重要的內(nèi)源性抑制因子[4-5]，在多種類型細(xì)胞和組織中均有表達(dá)，參與正常牙周組織的改建。MMPs及TIMPs的失衡可能是激活細(xì)胞外基質(zhì)，破壞基底膜細(xì)胞和牙槽骨的重要原因[3]。作者應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察AgP患者牙齦組織中MMP-8 和TIMP-1的表達(dá)情況，探討MMP-8和TIMP-1在 AgP發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2011年5月至2012年2月于廣東省口腔醫(yī)院牙周科就診的AgP患者和外科就診的需要進(jìn)行手術(shù)拔除埋伏牙的患者(對照組)。2組人群均符合以下入選條件:①全身無系統(tǒng)性疾病, 婦女非妊娠期, 未服用避孕藥，不吸煙。②近1 a內(nèi)未做過牙周治療, 3個(gè)月內(nèi)未服用過抗生素。③無明顯咬合關(guān)系異常, 無正畸治療史。AgP患者同時(shí)亦滿足以下條件：發(fā)病年齡在35歲以下， 全口至少有6顆患牙探診深度>5 mm, 鄰面附著喪失>3 mm,全口根尖片證實(shí)有鄰面牙槽骨吸收。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，AgP組共15例，男9例, 女6例, 年齡20～37歲，診斷均符合1999年牙周病分類法國際研討會(huì)所制定的標(biāo)準(zhǔn), 其中2例被診斷為局限型AgP, 其余13例均為廣泛型AgP。對照組20例，男12例, 女8例，年齡20～30歲，全口牙周檢查探診深度<3 mm, 無附著喪失, 出血指數(shù)>2的位點(diǎn)不超過10%。研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2臨床檢查采用Florida探針進(jìn)行全口牙齒的探查和記錄。指標(biāo)包括菌斑指數(shù)(plaque index, PLI)、探診深度(probing depth, PD)、出血指數(shù)(bleeding index, BI)、附著喪失(attachment loss,AL)、松動(dòng)度以及根分叉病變。牙周炎患者拍攝全口根尖片。

1.3牙齦組織中MMP-8和TIMP-1蛋白的檢測

局麻下在患牙唇頰側(cè)牙齦近、遠(yuǎn)中垂直切至牙周袋底或齦溝底, 另在袋底或溝底行水平切口, 獲取牙齦標(biāo)本。用滅菌生理鹽水沖洗后，多聚甲醛固定, 脫水, 透明, 石蠟包埋， 3 μm厚連續(xù)切片, 采用多聚賴氨酸防脫片, 60 ℃烤片2 h。采用二步法(無生物素PV6000系列)行免疫組化染色。對組織切片行二甲苯脫蠟, 梯度乙醇脫水后，Tris-EDTA(pH 9.0)抗原修復(fù)液微波修復(fù)15 min(中低火8 min，低火7 min)，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫孵育10 min,正常山羊血清室溫下孵育30 min,滴加15 mg/L TIMP-1抗體(R&D公司，MAB970)和8 mg/L MMP-8抗體(PL laboratories，PL031913R)，4 ℃孵育過夜。 加非生物素標(biāo)記的二抗IgG 37 ℃ 孵育15 min。每步驟間均用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗3次, 每次5 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染,鹽酸乙醇分化，脫水，透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對照。于400倍光鏡下，每張切片選擇10個(gè)有代表性的視野拍攝，應(yīng)用Image Pro plus圖片分析測量軟件分析圖片，計(jì)算平均光密度值，以此代表目的蛋白表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。因蛋白表達(dá)水平不滿足正態(tài)分布，故采用兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。應(yīng)用ROC曲線分析MMP-8、TIMP-1表達(dá)和MMP-8/TIMP-1的診斷價(jià)值，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組牙齦組織中MMP-8和TIMP-1蛋白的表達(dá)見圖1和表1。MMP-8和TIMP-1表達(dá)于牙齦組織的上皮內(nèi)及上皮下結(jié)締組織。AgP組MMP-8表達(dá)水平及MMP-8/TIMP-1高于對照組，但2組TIMP-1的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 2組牙齦組織中MMP-8 和TIMP-1蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表1 2組牙齦組織中MMP-8、TIMP-1表達(dá)水平和MMP-8/TIMP-1的比較

表內(nèi)數(shù)據(jù)為M(P25～P75)。

2.2診斷分析ROC曲線見圖2。AUC(MMP-8)=0.752，95%CI=0.618～0.885(P=0.003),有一定診斷價(jià)值；AUC(MMP-8/TIMP-1)=0.913，95%CI=0.831～0.996(P<0.001),具有較高診斷價(jià)值;AUC(TIMP-1)=0.347，95%CI=0.194～0.499(P=0.068),無診斷價(jià)值。MMP-8與MMP-8/TIMP-1的診斷效率見表2。

圖2 ROC曲線

表2 MMP-8與MMP-8/TIMP-1的診斷效率

3 討論

牙周病是人類口腔的兩大疾病之一[6]。AgP是一類發(fā)病年齡輕、進(jìn)展迅速且破壞嚴(yán)重的牙周疾病。在牙周組織的破壞過程中，結(jié)締組織的降解和骨組織的破壞主要通過誘導(dǎo)活化宿主細(xì)胞內(nèi)的酶來實(shí)現(xiàn)。這些酶中，較為重要的一類是MMPs，它們是降解細(xì)胞外基質(zhì)(包括膠原、蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)成分)的主要酶系，MMPs和其內(nèi)源性抑制因子TIMPs的失衡可能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生或加重疾病的進(jìn)展[3，7]。MMP-8又被稱為中性粒細(xì)胞型膠原酶，主要由多形核白細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，也可由牙齦成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、齦溝上皮細(xì)胞、漿細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生。Teles等[8]發(fā)現(xiàn)唾液中MMP-8的表達(dá)與牙齦出血指數(shù)相關(guān)。Sorsa等[9-10]發(fā)現(xiàn)牙周炎患者的齦溝液中存在大量的MMP-8活化形式，并指出MMP-8可以作為牙周炎的一個(gè)生物學(xué)診斷指標(biāo)，但同時(shí)Sorsa等指出由于沒有統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)方法和充足的證據(jù)，這種觀點(diǎn)又具有一定的局限性。2013年，Gursoy等[11]通過檢測牙周炎患者唾液中MMPs及Ⅰ型膠原纖維降解后的終末產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，MMP-8是一個(gè)可以有效區(qū)分重度和輕度牙槽骨吸收及健康人的生物標(biāo)記物。

TIMP-1是MMPs的重要抑制因子之一，同時(shí)也參與了MMPs的運(yùn)輸和穩(wěn)定[2，12]。TIMP-1在多種細(xì)胞類型和組織中均有表達(dá)，可由多種牙周細(xì)胞分泌，如成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、上皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞。TIMPs通常與MMPs按11形成MMP-TIMP復(fù)合體，通過特異性地結(jié)合MMPs的活性中心來抑制其活性，參與細(xì)胞外基質(zhì)的生理改建和各種病理過程。活化的MMPs和TIMPs的平衡是細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定的前提條件，二者的失衡將導(dǎo)致一系列的病理改變，在牙周疾病的組織破壞過程中發(fā)揮重要作用[13-14]。劉楚峰等[15]證實(shí)TIMP-1參與了正畸牙周組織改建過程中Ⅰ型膠原代謝的調(diào)節(jié)。Sorsa等[9]運(yùn)用ELISA、免疫熒光染色試劑盒或液相芯片技術(shù)分析慢性牙周炎患者的唾液后認(rèn)為，重度牙周炎患者唾液中MMP-8水平和MMP-8/TIMP-1顯著高于正常人群 。Mouzakiti等[16]證明牙周治療可以顯著提高慢性牙周炎患者TIMP-1的表達(dá)，降低MMPs/TIMP-1。

該研究發(fā)現(xiàn)正常人和AgP患者牙齦組織的上皮內(nèi)及上皮下結(jié)締組織中均有MMP-8的表達(dá)；AgP患者牙齦組織中MMP-8呈強(qiáng)陽性表達(dá)，主要表達(dá)于改建的結(jié)締組織區(qū)，AgP組MMP-8陽性表達(dá)率高于對照組，說明MMP-8在AgP發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但AgP組牙齦組織中TIMP-1的表達(dá)與對照組相比差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Gursoy等[10]證實(shí)牙周炎患者唾液中TIMP-1水平低于正常。結(jié)果的不一致可能是由于研究人群和種族的不同、樣本量不足或標(biāo)本不同造成的。

宿主和(或)微生物來源的生物標(biāo)記物聯(lián)合檢測可以大大提高疾病的診斷率。Sorsa等[9]指出唾液中MMP-8水平和MMP-8/TIMP-1可以用作牙周疾病大范圍普查時(shí)的有效診斷指標(biāo)。該研究結(jié)果提示牙齦組織中MMP-8表達(dá)水平對AgP有一定的診斷價(jià)值，而MMP-8/TIMP-1有較高的診斷價(jià)值，TIMP1無明顯的診斷意義，與2010年Sorsa等[9]在唾液中的研究結(jié)果相符合。

綜上所述，MMP-8與AgP發(fā)生、發(fā)展過程關(guān)系密切，MMP-8和MMP-8/TIMP-1可以作為診斷AgP的潛在指標(biāo)。但MMP-8和TIMP-1與細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)控關(guān)系較為復(fù)雜，二者在AgP中的作用機(jī)制，需從分子生物學(xué)水平進(jìn)一步研究。

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