益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法單劑與合劑對肝纖維化大鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1受體表達的影響

李 艷 曹文富 (重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，重慶 401331)

轉(zhuǎn)化生長因子β-1(TGF-β1R)是目前已知致肝纖維化最強的細胞因子，在形成肝纖維化的過程中起著至關重要的作用〔1〕。TGF-β1R 又是通過結(jié)合 TGF-β1R 來發(fā)揮作用〔2〕。肝纖維化的中醫(yī)病機眾多中醫(yī)界人士認為其中心環(huán)節(jié)是痰濁膠結(jié)加之氣虛血瘀促成。近年一些文獻報道有采用益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法治療肝纖維化，以及四種方法結(jié)合治療肝纖維化的文獻報道。但是，益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法四種方法單獨應用和合用到底有什么療效上的區(qū)別?我們在臨床應用中到底如何在這幾種方法上進行選擇仍然是臨床上困惑的問題，而當前對于它們之間療效有什么差別尚無文獻報道。理清這幾種治療，對于我們今后采用中醫(yī)中藥治療肝纖維化過程中，如何權(quán)衡選擇單獨劑量治療還是合用治療?對于我們判斷用藥的選擇具有非常重要的意義。而中醫(yī)、西醫(yī)在臨床應用中到底如何在這幾種方法上進行選擇仍然是臨床上困惑的問題，而當前對于它們之間療效有什么差別尚無文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 雄性SD大鼠130只，清潔級，體重180～220 g，由重慶醫(yī)科大學動物中心提供〔許可證號 syxk(渝)20070001〕。

1.2 藥物 (1)精選中藥黃芪、白術(shù)，混合水提并濃縮成益氣口服制劑(每毫升含生藥2 g);(2)精選中藥川芎、姜黃，混合水提并濃縮成化瘀口服制劑(每毫升含生藥2 g);(3)精選中藥半夏、海藻，混合水提并濃縮成化痰口服制劑(每毫升含生藥2 g);(4)精選中藥鱉甲、白芍，混合水提并濃縮成養(yǎng)陰口服制劑(每毫升含生藥2 g);(5)精選中藥黃芪、白術(shù)、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍、鱉甲，混合水提并濃縮成益氣化瘀化痰養(yǎng)陰口服制劑(每毫升含生藥2 g)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 130只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組10只(純水灌胃)、肝纖維化模型組20只(純水灌胃)、益氣組20只(益氣劑灌胃)、化瘀組20只(化瘀劑灌胃)、化痰組20只(化痰劑灌胃)、養(yǎng)陰組20只(養(yǎng)陰劑灌胃)、益氣化瘀化痰養(yǎng)陰組20只(益氣化瘀化痰養(yǎng)陰劑灌胃)。

1.3.2 造模方法 除正常對照組大鼠給予正常普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組大鼠(1)給予39.5%玉米面+40%面粉+20%豬油+0.5%膽固醇組成的高脂低蛋白飼料。(2)采用背部皮下注射CCL4油劑，每周2次，共計12 w。第1周的2次皮下注射劑量皆為0.5 ml/100 g體重，以后每次注射劑量為0.3 ml/100 g體重，安排每周星期二和星期五進行。建立肝纖維化大鼠模型，并將試驗大鼠隨機分入相應各組。(3)每天5%酒精作為唯一飲料。

1.3.3 給藥方法 (1)各組實驗大鼠中藥制劑均按約3 ml/100 g劑量灌胃。(2)肝纖維化模型組:20只大鼠生理鹽水灌胃(劑量約3 ml/100 g)。(3)正常對照組:10只大鼠生理鹽水灌胃(劑量約3 ml/100 g)。

1.3.4 標本留取 最后一次用藥后24 h，麻醉大鼠，斷頭處死大鼠取肝臟，取部分肝組織用10%中性甲醛溶液或二醛-鋨酸雙重固定，待做免疫組化或電鏡檢查，其余標本于液氮中冷凍后再轉(zhuǎn)移到-70°冰箱中保存。

1.4 觀察指標

1.4.1 肝組織形態(tài) 采用HE染色法，光鏡觀察肝小葉結(jié)構(gòu)、肝板排列、中央靜脈等。

1.4.2 Masson三色膠原染色 切片脫蠟后于0.5%碘酒精作用10 min，稍水洗，5%硫代硫酸鈉作用5 min，流水沖洗10 min，Weiger氏鐵蘇木素染5～10 min，流水稍洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數(shù)min，麗春紅酸性品紅液染5～10 min，蒸餾水稍沖洗，1%磷鉬酸水溶液處理約5 min，苯胺藍液復染5 min，1%冰醋酸處理1 min，梯度脫水，二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.4.3 RT-PCR法檢測肝組織TGF-β1R mRNA表達 提取大鼠肝組織總RNA，然后在42℃ 20 min條件下逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。于Genebank中查的大鼠TGF-β1R和GAPDH整個核酸序列，利用Premier5.0查得其引物并合成，退火溫度55℃。PCR反應條件預變性94℃3 min，變性94℃30 s，退火55℃30 s，延伸72℃1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。反應結(jié)束后取PCR產(chǎn)物再濃度為1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。在紫外燈光下觀察電泳結(jié)果。凝膠在Bio-Rad公司所生產(chǎn)的凝膠成像儀上用Quantityone4.6圖像分析軟件進行照相分析。各條帶的相對光密度值=目的條帶光密度值/內(nèi)參GAPDH條帶光密度值。GAPDH:上游:GTGGAGTCTACTGGCGTCTT;下游:GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT，擴增 275 bp TGF-βR1:上游:CCTGCTTCTCATCGTGTT下游:CTTTGTTGTCTGCTGCTAT，擴增548 bp。

1.4.4 Western印跡法檢測肝組織TGF-β1R蛋白表達 行為檢測后，直接斷頭處死大鼠取肝臟后凍于-70℃冰箱。稱取一定量的肝臟組織，進行裂解和BCA蛋白定量，組織總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。30 g蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，3%BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBS-Tween洗膜后加HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，經(jīng)EC檢測系統(tǒng)檢測各組TGF-β1R蛋白表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用用方差分析和LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 肝組織形態(tài)學 光鏡下，正常組大鼠肝組織形態(tài)規(guī)則，內(nèi)皮細胞外側(cè)無基底膜存在，肝星狀細胞呈梭形或桿狀，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)無擴大，無纖維組織存在及炎性細胞浸潤;模型組大鼠肝臟匯管區(qū)擴大，纖維組織顯著增生，多數(shù)形成假小葉，肝細胞變性壞死，肝纖維化程度分期顯著增高;各治療組大鼠肝細胞變性壞死、肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和肝纖維化程度減低。見圖1。

2.2 Masson三色膠原染色結(jié)果 正常對照組大鼠肝組織切片顯示，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，其周圍無明顯膠原纖維沉積。模型組表現(xiàn)為重度脂肪變，肝血竇擴張、充血、水腫，匯管區(qū)纖維纖維組織增生非常明顯，肝內(nèi)膠原纖維組織增生明顯。益氣組可見肝血竇擴張、充血、水腫，肝細胞中度-重度脂肪變，肝內(nèi)膠原纖維組織輕度增生。化瘀組和化痰組均可見匯管區(qū)膠原纖維組織中度增生。養(yǎng)陰組可見匯管區(qū)和肝內(nèi)膠原纖維組織輕度增生。益氣化瘀化痰養(yǎng)陰共同治療組肝細胞變化不明顯，肝內(nèi)膠原纖維組織輕度增生。見圖2。

2.3 RT-PCR檢測 TGF-β1R mRNA的表達 與模型組(2.343 6±0.184 3)相比，治療組益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法中大鼠肝組織 TGF-β1R基因表達降低(1.964 7±0.179 8，1.746 1±0.180 8，1.743 1 ±0.192 2，1.513 7 ±0.177 8，P ＜0.01)，其中養(yǎng)陰法與化瘀組、益氣組、化痰組相比，大鼠肝組織TGF-β1R基因表達相對明顯降低(P＜0.05)。與益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法組相比，益氣化瘀化痰養(yǎng)陰組中大鼠肝組織TGF-β1R基因表達明顯降低(1.060 3±0.161 6，P＜0.05)。正常對照組TGF-β1R mRNA為0.886 7±0.168 6。見圖3。

2.4 Western印跡法檢測肝組織TGF-β1R蛋白表達 與模型組(1.826 7±0.080 8)相比，治療組益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法中大鼠肝組織 TGF-β1R蛋白表達降低(1.533 3±0.130 1，1.266 7±0.075 7，1.326 7 ±0.041 6，1.006 7 ±0.061 1，P ＜0.01)，其中養(yǎng)陰法與化瘀組、益氣組、化痰組相比，大鼠肝組織TGF-β1R蛋白表達相對明顯降低(P＜0.05)。與益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法組相比，益氣化瘀化痰養(yǎng)陰組中大鼠肝組織TGF-β1R蛋白表達明顯降低(0.540 0±0.052 9)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。正常對照組TGF-β1R蛋白表達量為0.346 7±0.061 1。見圖4。

圖1 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法單劑與合劑對肝纖維化大鼠肝組織的HE染色(×400)

圖2 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法單劑與合劑對肝纖維化大鼠肝組織的Masson三色膠原染色(×400)

圖3 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法單劑與合劑對肝纖維化大鼠TGF-β1R mRNA的表達影響

圖4 益氣化瘀化痰養(yǎng)陰法單劑與合劑對肝纖維化大鼠TGF-β1R蛋白表達的影響

3 討論

肝纖維化是肝組織對慢性損傷的修復反應，是多種類型細胞、氧化應激、細胞因子和生長因子等一系列復雜作用的結(jié)果，以細胞外基質(zhì)(ECM)成分的過度增生與異常沉積為主要特征〔3〕。肝纖維化作為一種慢性、進行性、彌漫性的肝臟病變，治療不及時或治療不當都可使其發(fā)展為肝硬化。許多文獻表明，TGF-β1是目前已知致肝纖維化最強的細胞因子，在形成肝纖維化的過程中起著至關重要的作用，而TGF-β1R通過結(jié)合TGF-β受體復合物來發(fā)揮作用，因此，TGF-β1R同樣作為肝纖維化程度參考的重要指標〔1，2〕。Smads蛋白已被證實為 TGF-β 家族的特異性細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導分子，調(diào)控著TGF-β家族的正、負反饋。許多文獻報道TGF-β1R也可以依賴 Smad信號通路，來激活 PI3K、ERK、JNK、p38 信號通路〔4，5〕。總之，TGF-β1R 通過結(jié)合 TGF-β1 型受體激活MAPK和Smad信號通路促使肝星狀細胞活化，從而導致過量細胞外基質(zhì)的沉積最終導致肝纖維化〔6，7〕。因此說明 TGF-β1R在肝纖維形成過程中起著重要的作用。

西藥治療肝纖維化的藥物雖然在臨床上取得一定的療效，但是出現(xiàn)的多種不良反應而使其在臨床上應用受到限制。近年來，中醫(yī)中藥抗肝纖維化顯現(xiàn)出了明顯的療效優(yōu)勢。實驗及臨床研究顯示中藥多種單味中藥提取物或中藥復方都有確切的抗肝纖維化作用。本研究結(jié)果顯示，中草藥采用益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四種單劑治療法都可以降低肝組織內(nèi)纖維化程度，降低大鼠肝組織TGF-β1R基因和蛋白表達。益氣藥白術(shù)在臨床經(jīng)驗配伍中起到較好的抗肝纖維化效果，同時現(xiàn)代藥理研究證實，黃芪可以顯著抑制實驗性肝纖維化大鼠模型的肝纖維化，可以在蛋白水平增強 MMP-2酶蛋白的表達，同時抑制TIMP-2酶蛋白的表達，促進ECM的降解，從而達到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的目的〔8〕。姜黃素為姜黃根莖中提取的天然色素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎及抗病毒等生物學活性，并且近幾年的研究表明姜黃體外可抑制肝星狀細胞(HSC)增殖，降低α-SMA的表達并誘導其凋亡等功能，能夠明顯抑制肝纖維化形成〔9〕。姜黃素抑制肝纖維化大鼠脂質(zhì)過氧化物的生成及肝臟TGF-β1R和PDGF的表達〔10〕。川芎之有效成分川芎嗪可能通過降低TGF-β的表達以及改善Smad3與Smad7之間的失衡，從而具有明顯的逆轉(zhuǎn)肝纖維化作用〔11〕。川芎能明顯抑制CCL4誘導的大鼠肝組織肝纖維化組織中TGF-β1R表達，對肝組織有明顯的保護和治療作用〔12〕。有研究顯示，從海藻中提取物可能提高毛細血管內(nèi)脂蛋白脂酶活性并促進該酶釋放，有效降低和降低肝臟總膽固醇TG、TC含量〔13〕。對于中藥鱉甲治療肝纖維化的研究更為廣泛，鱉甲提取物通過降低Ⅳ型膠原和Ⅲ型膠原的含量而發(fā)揮抗肝纖維化的作用〔14〕。從前述的諸多研究中，可以看出，四種單獨治療方法都有效緩解肝纖維化的功能。但是在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，在單獨應用中，益氣法效果略差，化瘀與化痰兩者療效沒有明顯差異，其中養(yǎng)陰法又能體現(xiàn)更好的療效，說明鱉甲、白芍具有更好的抗肝纖維化的作用。

肝纖維化根據(jù)中醫(yī)學領域根據(jù)臨床癥候特點，可歸屬于中醫(yī)“脅痛”、“積聚”、“痰凝”、“黃疸”等病范疇。在我們的研究同時發(fā)現(xiàn)，益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四種治療方法綜合應用比單劑更能夠有效降低肝組織內(nèi)纖維化程度，降低TGF-β1R的基因和蛋白表達，說明單獨治療雖然有效，減緩肝纖維化的嚴重程序，但是仍然不能發(fā)揮應有的效果。如果綜合應用四法，可以互相彌補各自的不足和欠缺，真正符合中醫(yī)理論“互根互用”的療效配伍理論體系。本實驗以CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型為研究對象，觀察經(jīng)益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰四種單劑和綜合應用療后有效降低大鼠肝纖維組織學變化，有效達到干預TGF-β1R表達的影響。而綜合幾種方法的療效特點，說明益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法可通過抑制TGF-β1R產(chǎn)生和表達，來抑制細胞外基質(zhì)形成和促進ECM降解，改善肝組織器官代謝狀況等途徑，從而抑制與延緩肝纖維化的進程，控制肝纖維化這類難治性疾病的進展之目的。

總之，采用肝纖維因子的重要指標作參考依據(jù)，評價益氣、化瘀、化痰、養(yǎng)陰法等治療肝纖維化的治療效果，對于深入闡釋中醫(yī)藥益氣化瘀化痰法治療肝纖維化的機制，不斷提高中醫(yī)藥防治肝纖維化的水平，促進學科進步具有重要意義。

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