慢病毒介導RNA干擾心房區心肌細胞Kir2.2基因對Kv2.1鉀通道及內向整流鉀電流的影響

王曉萍 吳 蔚 邵 冰 宋平南 孫 琳

(沈陽醫學院沈洲醫院心血管一病房，遼寧 沈陽 110002)

病態竇房結綜合征是一種常見心律失常，嚴重影響患者的生活質量，甚至可導致心源性猝死。盡管電子起搏器、阿托品或心迷走神經消融術在治療該病上有一定的效果，但仍具有使用或靶向較差的不足，故急需探索有效簡單且并發癥較小的治療方法〔1～3〕。近年來生物起搏器研究已成為緩慢心律失常治療領域的新熱點。Kv2.1通道是竇房結、心房和房室結興奮的主要調節蛋白，該通道屬于內向整流鉀通道，通道是由四個α亞單位構成的功能性內向整流鉀通道，在起搏電位的發生中具有重要作用〔4，5〕。Kir2.2基因可編碼心臟Kv2.1通道中α亞單位的基因〔6〕，故推測可從分子水平對Kir2.2基因進行干擾治療，使Kv2.1通道失活，從而阻斷其在緩慢性心律失常中的作用，達到治療病態竇房結綜合征的目的。本研究探討慢病毒介導RNA干擾心房區心肌細胞Kir2.2基因對Kv2.1鉀通道及內向整流鉀電流的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 二甲亞砜(DMSO)、胎牛血清、TritonX100，美國Sigma公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、辣根過氧化物酶(HRP)標記鼠二抗單克隆抗體，美國Santa Cruz公司;Kv2.1多克隆抗體，美國Cell Sigaling Technology公司;PCR試劑盒，Biouniquer公司;RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司);脂質體LipofectamineTM2000，上海Invitrogen公司;慢病毒包裝系統pGCSIL-綠色熒光蛋白(GFP)載體和 pHelper1.0載體、pHelper2.0載體，Gene script公司;小干擾序列以及引物，上海吉凱公司;小干擾序列以及引物，上海吉凱公司;M-MLVRTase、質粒抽提試劑盒，美國Promega公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒，碧云天生物科技公司;DMEM培養基，美國Hyclone公司;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 心房區心肌細胞培養 取1～3日齡的Wistar大鼠，于無菌環境下剪取心臟，保留心房，并置于預冷的D-Hank溶液中漂洗干凈。用眼科小彎將組織充分剪碎，加入5倍體積的0.08%胰蛋白酶溶液消化3～5 min(37℃)，靜置后棄上清，將沉淀再加入約5倍體積0.08%胰蛋白酶及0.1%膠原酶混合液，將上清液移入離心管，反復吹打至無細胞團塊后，用含胎牛血清的DMEM培養液終止消化，1 000 r/min離心處理10 min，棄掉上清后將細胞重懸于含胎牛血清的DMEM培養液中，按1×105個/ml將細胞接種于10 ml培養瓶中，置于37℃，5%CO2培養箱中進行培養，每8～12 h更換培養液。

1.2.2 pGCSIL-GFP/Kir2.2-siRNA慢病毒載體的構建與鑒定根據GenBank中 Kir2.2序列，利用 siRNA sequence selector設計針對Kir2.2特異性siRNA序列，siRNA插入序列正義鏈:5'-TATTCTTGGAGAGGCCATGTA-3'，反義鏈:5'-GTCTGAGGTGCGTATCATA-3'。將靶向Kir2.2基因的siRNA表達序列連接到慢病毒載體pGCSIL中，獲得pGCSIL-Kir2.2-siRNA重組質粒，并進行測序鑒定。pGCSIL-GFP-siRNA重組質粒的構建方式相同。

1.2.3 攜帶Kir2.2基因重組慢病毒的包裝和病毒滴度的測定 將對數生長期的293T細胞用0.25%胰酶消化處理，并以1.0×107個/ml的密度將細胞接種于培養皿，轉染前提前2 h將培養基更換為無血清培養基，當細胞密度約70%時，將重組慢病毒骨架質粒與包裝輔助質粒用LipofectamineTM2000共轉染至293T包裝細胞，48 h后收集病毒上清液，4℃ 4 000 r/min離心10 min去除細胞碎片，濾器過濾上清液并進行濃度處理。用逐孔稀釋滴度測定法在293T細胞中測定病毒滴度。病毒滴度(TU/ml)=GFP陽性細胞率×細胞總數/(慢病毒液體積×慢病毒液稀釋倍數)。

1.2.4 重組慢病毒轉染心房區心肌細胞 取對數生長期的心肌細胞，0.25%胰酶消化處理，以1×105/ml的密度將心肌細胞接種至6孔板中。培養12 h后，用LipofectamineTM2000分別將質粒pGCSIL-GFP-siRNA轉染心肌細胞，以未轉染細胞做對照。3 d采用熒光顯微鏡觀察GFP的表達情況。

1.2.5 RT-PCR鑒定Kir2.2沉默效果 根據實驗設計分為三組:Control組(不行慢病毒轉染)、Ad-siRNA-null組(僅行空慢病毒轉染)和Ad-siRNA-Kir2.2組(行pGCSIL-Kir2.2-siRNA慢病毒轉染)。于感染后依據提取試劑盒說明書提取總RNA，進行RT-PCR。結果表示為Kir2.2與GAPDH的標準差。Kir2.2上游:5'-GGAGCGTGGCAACAGATAG-3';下游:5'-TCTCCCCCTTATTTGCTTCTTC-3'。GAPDH 上 游:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3';下游:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

1.2.6 Western印跡實驗 采用常規方法收集對數期心肌細胞，加入全蛋白提取緩沖液充分裂解細胞;高速離心12 000 r/min 20 min，取上清并測定蛋白濃度BCA法，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳。電泳條件:濃縮膠恒壓80 V約20 min，分離膠100 V約80 min。半干轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，Kv2.1的稀釋比例為分別為1∶200。4℃孵育過夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)漂洗PVDF膜，加入二抗(稀釋比例1∶3 000)。采用增強化學發光法(ECL)來顯色處理，膠片曝光后觀察蛋白的條帶，最終結果為為與GAPDH條帶光密度的比值。

1.2.7 全細胞膜片鉗記錄 全細胞膜片鉗記錄方法參照文獻〔7〕報道:選用橫紋肌清晰的心肌細胞，將拉制好的玻璃微電極(2～5 mΩ)形成高阻抗封接后，負壓破膜，并行全細胞記錄。在電壓鉗制下記錄離子通道電流，信號經過膜片鉗放大器、模數轉換器采集、貯存和分析。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，數據資料以s表示，兩組之間比較采用成組t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)。

2 結果

2.1 重組慢病毒表達載體的構建與鑒定及滴度測定 Kir2.2-siRNA核苷酸鏈序列插入正確，成功構建了針對大鼠Kir2.2-siRNA的siRNA，病毒測定滴度為2.1×109TU/ml。

2.2 病毒顆粒感染心房區心肌細胞 轉染前細胞形態較好，呈單層生長，均勻分布。用攜帶報告基因GFP的慢病毒載體(pGCSIL-GFP-siRNA)感染心房區心肌細胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察發現綠色熒光，超過80%的細胞均可檢測GFP(MOI=50)，載體可正確表達。見圖1。

2.3 RNA干擾對Kir2.2基因表達的影響 與Control組相比，Ad-siRNA-Kir2.2組的Kir2.2 mRNA水平降低，差異有統計學意義(P＜0.05);Ad-siRNA-null組的Kir2.2 mRNA水平與Control組無差異(P＞0.05)。見表1，圖2A。

2.4 RNA干擾對Kv2.1鉀通道水平的影響 與Control組相比，Ad-siRNA-Kir2.2組的Kv2.1鉀通道蛋白水平降低，差異有統計學意義(P＜0.05);Ad-siRNA-null組的Kv2.1鉀通道蛋白水平與Control組無差異(P＞0.05)。見表1，圖2B。

圖1 pGCSIL-GFP-siRNA感染心房區心肌細胞后GFP的表達情況(×100)

圖2 RNA干擾對Kir2.2基因表達和Kv2.1鉀通道水平的影響

表1 三組的Kir2.2基因表達和Kv2.1鉀通道水平(s)

表1 三組的Kir2.2基因表達和Kv2.1鉀通道水平(s)

與Control組比較:1)P＜0.05;與Ad-siRNA-null組比較:2)P＜0.05

Kir2.2 mRNA Kv2.1 0.54±0.12 0.81±0.16 Ad-siRNA-null組 0.57±0.14 0.79±0.83 Ad-siRNA-Kir2.2組 0.32±0.061)2) 0.53±1.311)2)Control組蛋白組別

2.5 RNA干擾對Ik1峰值電流密度的影響 Ad-siRNA-Kir2.2組的峰值電流密度為(-73.66±8.57)pA/pF，Control組和AdsiRNA-null組分別為(-142.85±15.72)pA/pF和(-139.63±14.86)pA/pF，Ad-siRNA-Kir2.2組的IK1減弱，峰值電流密度低于其余兩組(P＜0.05)，Control組和Ad-siRNA-null組無差異(P＞0.05)。見圖3A。

2.6 RNA干擾對Ik1的電流-電壓曲線的影響 與Control組相比，Ad-siRNA-Kir2.2組的電流-電壓曲線上移;內向電流(-100 mV)降低(23.48±5.67)% ，外向電流降低(31.09±6.27)%;與Ad-siRNA-null組相比，Ad-siRNA-Kir2.2組的電流-電壓曲線上移;內向電流(-100 mV)降低(22.95±5.73)%，外向電流降低(32.64±6.81)%;Control組和Ad-siRNA-null組無差異(P＞0.05)。見圖3B，3C。

圖3 三組的Ik1相關指標情況

3 討論

安裝電子起搏器是目前治療病態竇房結綜合征的主要方法，但該方法存在感染、壽命短須定期更換等缺陷〔1〕。口服阿托品或心迷走神經消融可使多數病人心率明顯提高而避免安裝起搏器〔2，3〕。然而前者使用麻煩、存在多種副作用，后者消融靶點不易確定，且并發癥多。近年來生物起搏器研究已成為緩慢心律失常治療領域的新熱點。

基因治療是通過借助質粒或病毒載體來對某個或某些基因的水平進行調整來達到影響基因生理功能的方法〔8〕，有望成為生物起搏器的實現形式。Edelberg等〔9〕首先用整合了編碼β2-腎上腺素受體基因的質粒注射到豬心房區使心率明顯增快，對β-腎上腺素刺激的反應明顯超過對照組，提示基因治療具有可行性。過表達Kir2.1(編碼轉運內向整流電流IK1通道Kv2.1的1個α亞單位基因)，下調外向超極化電流使內向電流引起膜除極化，從而產生起搏電位〔10〕，提示Kv2.1在起搏電位的發生中具有重要作用;鑒于Kir2.2基因也參與編碼Kv2.1的一個α亞單位，因此推測通過RNAi的手段下調新房區心肌細胞Kir2.2基因表達，可阻斷其編碼的Kv2.1鉀通道的形成，從而阻斷心迷走神經介導的負性心率及負性心臟傳導作用。

本研究采用慢病毒載體來構建攜帶Kir2.2基因干擾RNA載體，具有表達時間長、穩定性好及可整合入宿主細胞基因組等優點〔11，12〕，廣泛用于研究特定基因過表達、基因沉默及啟動子的調控〔13～15〕。因此，本研究成功構建攜帶Kir2.2基因的小干擾RNA的慢病毒載體，測序發現序列插入正確，而熒光顯微鏡觀察發現有GFP表達，表明載體可在心肌細胞內正確表達。與Control組相比，Ad-siRNA-Kir2.2組的Kir2.2基因的mRNA水平下降，表明干擾后的細胞Kir2.2基因的表達受到明顯抑制，提示在通過RNA干擾來下調Kir2.2基因表達可行。采用Western blot觀察發現:Ad-siRNA-Kir2.2組的Kv2.1鉀通道的蛋白水平低于Control組，表明針對Kir2.2基因的RNA干擾可降低Kv2.1鉀通道的蛋白水平，主要的原因是Kir2.2基因表明該蛋白的一個亞基，故下調Kir2.2基因的表達可降低Kv2.1鉀通道的蛋白水平。本研究的另一個發現是Ad-siRNA-Kir2.2組的內向整流鉀電流受到抑制，如電流密度降低，且電流-電壓曲線上移，內向電流(-100 mV)和外向電流(-60 mV)均降低，提示下調Kir2.2基因的表達可抑制內向整流鉀電流，主要與其降低Kv2.1鉀通道的蛋白水平有關。

綜上所述，慢病毒介導RNA干擾心房區心肌細胞Kir2.2基因可降低Kv2.1鉀通道的表達并抑制內向整流鉀電流，具有一定的潛在臨床價值。從細胞及整體水平探索以基因治療為基礎的生物起搏器治療病態竇房結綜合征的新途徑，為改善緩慢性心律失常患者生活質量及彌補電子起搏器的不足提供新思路。

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