生黃合劑對大鼠心肌缺血再灌注損傷的干預作用

閆文翠 王 晶 張維娜 高玉峰 張鳳英 李 欣 (承德護理職業(yè)學院，河北 承德 067000)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是心肌缺血后在一定時間內恢復血供，缺血心肌發(fā)生的更嚴重的損傷。MIRI的可能機制有氧化應激損傷、鈣超載、炎癥反應、細胞凋亡等，如何減輕MIRI一直是醫(yī)學界研究的熱點。生黃合劑由黃芩莖葉總黃酮和生脈飲組成。前期實驗研究證明〔1～4〕，生黃合劑具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用，黃芩莖葉總黃酮與生脈飲具有交互作用，二者合用的效果優(yōu)于單獨使用。本實驗觀察生黃合劑預處理對大鼠MIRI的影響，探討生黃合劑對心肌保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 黃芩莖葉總黃酮(由承德醫(yī)學院中藥研究所提供，采用黃芩莖葉大孔吸附樹脂提取法，純度為61.8%，批號:010608)、生脈飲(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號:1261143)、復方丹參滴丸(天津天士力制藥股份有限公司，批號:110602)。肌酸激酶(CPK)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司，TUNEL試劑盒購自河北博海生物工程有限公司，DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.2 動物分組、給藥及模型制備

1.2.1 動物分組及給藥 健康SD大鼠48只，雌雄各半，體重250～300 g，北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供〔合格證號:SCXK(京)2006-0008〕。隨機分為6組，空白對照組、模型組、陽性藥物組、生黃合劑低、中、高劑量組，每組8只。空白對照組、模型組灌等體積生理鹽水，陽性藥物組給予復方丹參滴丸(135 mg/kg)、低、中、高劑量組分別給予不同劑量的生黃合劑(黃芩莖葉總黃酮17.5、35、70 mg/kg均加入5 ml/kg生脈飲溶解)，均按0.5 ml/100 g灌胃，1次/d，給藥7 d。給藥結束后，除空白對照組(冠脈前降支僅穿線不結扎)外其他組均建立MIRI模型。

1.2.2 MIRI模型制備 大鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉(1 ml/100 g)，取仰臥位固定，用針形電極插入大鼠四肢皮下記錄標準肢體Ⅱ導聯(lián)心電圖。頸部正中切口，氣管插管，接人工呼吸機。于胸骨左緣3～4肋間切開胸壁，暴露心臟，在左心耳與肺動脈之間結扎左冠狀動脈前降支，同時在結扎線與血管之間穿一直徑2 mm、長5 mm的硅膠管，結扎30 min;然后剪斷結扎線，取出硅膠管，再灌注2 h，空白對照組僅穿線不結扎，同步監(jiān)測肢體Ⅱ導聯(lián)心電圖。以左心室前壁發(fā)紺和同步心電圖Ⅱ導聯(lián)ST段抬高為結扎成功標志，以左心室前壁由發(fā)紺漸變紅潤及ST段降低1/2為再灌注標志〔5〕。

1.3 指標檢測

1.3.1 血清CPK、AST、LDH活性的測定 再灌注結束后經心臟采血，4 000 r/min離心10 min，分離血清，置于－20℃冰箱備用，待血清收齊后嚴格按試劑盒說明書要求檢測血清CPK、AST、LDH的含量。

1.3.2 心肌組織TNF-α含量的測定 采血后立即取出心臟，在結扎線以下剪取左心室前壁心肌，其中1/2心肌用10%甲醛固定，石蠟包埋，用于細胞凋亡的檢測;另外1/2心肌放入液氮中保存，用于TNF-α的測定。標本收齊后取1 g凍存的心肌，制作組織勻漿，按ELISA試劑盒說明測定各組心肌組織中TNF-α的含量。

1.3.3 心肌細胞凋亡的檢測 按TUNEL試劑盒說明書檢測心肌細胞凋亡。光學顯微鏡下觀察，正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈深淺不一的棕黃色。每例切片隨機選取5個400倍視野，分別計數(shù)每個視野的凋亡細胞和細胞總數(shù)，以細胞凋亡指數(shù)(AI)作為凋亡程度的指標，取5個視野AI的均值。AI=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中CPK、AST、LDH含量測定 模型組血清CPK、AST、LDH含量高于空白對照組(P＜0.05);與模型組比較，各組藥組能明顯降低大鼠血清CPK、AST、LDH的含量(P＜0.05);生黃合劑高劑量組比低、中劑量組及陽性藥物組降低作用明顯(P＜0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠心肌組織TNF-α含量的測定 模型組心肌組織TNF-α含量高于空白對照組(P＜0.05);與模型組比較，各用藥組能明顯降低大鼠心肌組織TNF-α含量(P＜0.05)，其中以生黃合劑高劑量組作用較為明顯，與陽性藥物組、生黃合劑低、中劑量組比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 心肌細胞凋亡情況的檢測 與空白對照組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，各用藥組心肌細胞凋亡指數(shù)降低(P＜0.05);生黃合劑高劑量組心肌細胞凋亡指數(shù)低于生黃合劑低、中劑量組(P＜0.05)，但高劑量組與陽性藥物組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1、圖 1。

表1 各組大鼠CPK、AST、LDH、TNF-α含量及AI的比較 (n=8，s)

表1 各組大鼠CPK、AST、LDH、TNF-α含量及AI的比較 (n=8，s)

與空白對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與高劑量組比較:3)P＜0.05

組別 CPK(kU/L)AST(U/L)LDH(kU/L)TNF-α(pg/g)AI(%)空白對照組 1.98±0.14 264.69±19.09 3.53±0.29 353.53±18 20/0.000 266.587/0.000.15 4.30±1.87模型組 4.20±0.191) 637.52±14.561) 4.12±0.111) 905.20±19.211) 34.82±1.451)陽性藥物組 3.34±0.112)3) 457.67±23.752)3) 3.67±0.192)3) 678.33±24.762)3) 21.23±1.652)生黃合劑低劑量組 3.76±0.202)3) 474.74±18.982)3) 3.74±0.252)3) 837.67±23.622)3) 31.51±2.132)3)生黃合劑中劑量組 3.39±0.182)3) 460.83±21.312)3) 3.68±0.212)3) 655.33±17.572)3) 26.71±2.012)3)生黃合劑高劑量組 2.41±0.192) 358.96±15.682) 3.49±0.312) 548.33±21.522) 20.81±1.962)F/P值 172.32/0.000 114.83/0.000 22.13/0.000 494.

圖1 各組大鼠心肌細胞凋亡TUNEL染色觀察(×400)

3 討論

MIRI時，心肌細胞內的CK、AST、LDH因釋放而減少，血清中CK、SAT、LDH活性增加，所以測定血清中 CK、SAT、LDH 活性能反映心肌組織損傷程度。本研究顯示，生黃合劑能顯著降低血清中CK、SAT、LDH的活性，減輕MIRI程度。

TNF-α主要由單核巨噬細胞分泌，是一種主要的炎癥細胞因子，在MIRI過程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)〔6〕TNF-α與MIRI關系密切。TNF-α能增加內皮細胞黏附分子的表達，增強中性粒細胞與內皮細胞的黏附，通過促進中性粒細胞釋放自由基和一些細胞毒性物，直接損害心肌細胞。本研究提示TNF-α參與缺血再灌注損傷的發(fā)生，生黃合劑能顯著降低心肌組織中的TNF-α水平，MIRI后引起的機體TNF-α水平升高的機制有待進一步探討。

研究〔7〕發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在缺血再灌注過程中發(fā)揮著重要作用，特別是在大腦和心臟。細胞凋亡的多少決定著缺血再灌注心肌損傷的嚴重程度，有效抑制細胞凋亡是促進缺血再灌注后心功能恢復和減輕心肌損傷的重要途徑之一。近年來研究〔8，9〕發(fā)現(xiàn)，藥物預處理可抑制心肌細胞凋亡，降低心肌梗死面積〔10〕，對缺血再灌注心肌細胞具有保護作用。本研究表明生黃合劑有抑制心肌細胞凋亡的作用，與龔明玉等〔8，9〕研究結果一致。

綜上，生黃合劑預處理對缺血再灌注損傷大鼠心肌具有保護作用，以生黃合劑高劑量組效果最明顯，其作用機制可能通過抑制心肌細胞凋亡和CK、SAT、LDH的釋放，降低心肌組織中的TNF-α水平實現(xiàn)的。

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