雷米普利治療心肌梗死大鼠對(duì)心肌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路分子蛋白表達(dá)水平的影響

劉月英 饒艷偉 王永杰 鄔志強(qiáng) (吉林省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，吉林 長春 130021)

核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB作為信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的樞紐，參與免疫、炎癥、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡以及血管生成等多種生理、病理過程的基因調(diào)控，是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB是一個(gè)由復(fù)雜的多肽亞單位組成的蛋白家族，廣泛存在于真核細(xì)胞中。NF-κB家族成員以同源二聚體或異源二聚體的形式與其抑制蛋白ⅠκBs形成復(fù)合物，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，只有在受到各種活化因素的作用后，ⅠκBs被磷酸化，NF-κB才能被激活〔1〕。心肌梗死是心血管疾病患者的重要死亡病因。研究發(fā)現(xiàn)雷米普利對(duì)心肌梗死后心衰有一定的療效，能改善心功能和延緩心衰的發(fā)生，提高患者的生存質(zhì)量，但是其作用機(jī)制還明確。有研究〔2，3〕顯示 NF-κB信號(hào)通路與心肌缺血有關(guān)系，在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步驗(yàn)證NF-κB家族成員在雷米普利治療心肌梗死中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 雄性Wistar大鼠40只，體重250～300 g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào):SCXK-(吉)2008-0005。雷米普利(Ramipril)購自賽諾菲安萬特制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào):C1001。NF-κB P50、NF-κB P65、P-ⅠκBα 抗體購于Santa公司。

1.2 心肌梗死大鼠模型的建立 參照Olivette的方法，乙醚吸入法麻醉大鼠，仰臥位固定。縱切皮膚，順斜紋肌方向鈍性分離肌肉開胸，剪破心包膜，擠出心臟，4-0號(hào)絲線結(jié)扎肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間下方1～2 mm處的一小束心肌組織，目測(cè)確認(rèn)阻塞部位的下方出現(xiàn)心肌缺血區(qū)域。假手術(shù)組進(jìn)行相同操作，但只穿線，不結(jié)扎心肌組織。4-0號(hào)絲線縫合胸部，保持溫度直至大鼠完全蘇醒。術(shù)后每日大鼠注射青霉素10萬單位/d，連續(xù)給藥5 d。結(jié)扎3 d后，乙醚麻醉大鼠，采用心臟彩色多普勒超聲儀觀察大鼠心功能，根據(jù)左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)的下降確定入選實(shí)驗(yàn)大鼠。術(shù)中及術(shù)后2 d死亡5只大鼠，去除LVEF下降不合格5只，剩余30只大鼠分組如下:假手術(shù)組(Sham)10只、模型組(MI)10只、雷米普利組10只〔3〕。術(shù)后1 w開始雷米普利灌胃給藥(1 mg/kg)，假手術(shù)組及模型組給予蒸餾水，術(shù)后5 w處死大鼠，留取心臟組織。

1.3 Western 印跡檢測(cè)心肌細(xì)胞中 NF-κB P50、NF-κB P65、PIκBα蛋白的表達(dá) 按照Western印跡步驟嚴(yán)格按試劑說明操作，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組NF-κB P50、NF-κB P65蛋白表達(dá)增高，P-ⅠκBα蛋白表達(dá)降低;與模型組相比，雷米普利組NF-κB P50、NF-κB P65、P-IκBα 蛋白表達(dá)增高(P ＜0.01)。見圖1。

圖1 心肌梗死大鼠心肌組織中NF-κBP50、NF-κBP65 和 P-IκBα蛋白的表達(dá)

3 討論

NF-κB家族由Rel蛋白家族成員以同源或異源二聚體的形式存在，它們均具有一個(gè)高度保守的Rel同源序列，該序列有著Rel蛋白間聚合和與ⅠκB結(jié)合的位點(diǎn)，同時(shí)也包含DNA識(shí)別序列和核定位序列。不同的NF-κB二聚體的轉(zhuǎn)錄激活特性不同，結(jié)合的靶DNA也不同，調(diào)控不同的基因表達(dá)，這可能是NF-κB功能多樣性的原因。NF-κB的主要形式為 P50和 P65組成的二聚體，P50是與DNA結(jié)合的部位，P65參與基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)，并可促進(jìn)P50與DNA結(jié)合，當(dāng)P65與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)抑制蛋白ⅠκB結(jié)合時(shí)，可掩蓋P50上核定位信號(hào)。NF-κB的激活與ⅠκB的磷酸化密切相關(guān)，但是不同的ⅠκB分子與NF-κB的結(jié)合表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。ⅠκBα能夠與任何包含反式作用亞單位的二聚復(fù)合體結(jié)合，特別是那些包含Rel A(p65)二聚復(fù)合體緊密結(jié)合，發(fā)揮抑制功能，但ⅠκBα與P50或P52的同源二聚體的結(jié)合卻并不能將后者有效地滯留在胞質(zhì)中。相對(duì)于Rel A、C Rel、Rel B 而言，κB 結(jié)合位點(diǎn)可以將ⅠκBα 從 P50、P52的同源二聚體結(jié)合部位替換下來。所以，NF-κB系統(tǒng)由NF-κB家族及其抑制物ⅠκB家族共同組成。心肌梗死大多是在冠狀動(dòng)脈長期和急劇性病變的基礎(chǔ)上，冠狀動(dòng)脈血流急劇減少或中斷，使缺血區(qū)域心肌減少或失去氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，從而出現(xiàn)嚴(yán)重而持久的心肌缺血，導(dǎo)致心肌缺血性壞死，引起心力衰竭，最終導(dǎo)致死亡。在臨床中應(yīng)用雷米普利治療急性心肌梗死2～9 d后出現(xiàn)的心力衰竭，可能與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)系〔4，5〕。同時(shí)有研究表明在心肌缺血再灌注〔6〕、心力衰竭〔7〕時(shí)可能也有NF-κB信號(hào)通路的參與。

研究顯示NF-κB信號(hào)通路分子在心肌梗死、心力衰竭等心臟疾病中有改變。本研究結(jié)果說明NF-κB信號(hào)通路在雷米普利治療心肌梗死大鼠中起到重要作用。

1 Baldwin AS.The NF-κB and ⅠκB Proteins:new discoveries and insights〔J〕.Annt Rev Immul，1996;14(2):649-83.

2 任法新，方毅民.急性心肌梗死急診PCI術(shù)后無復(fù)流與NF-κB、AP-1和GR水平關(guān)系的研究〔J〕.中國心血管病研究，2008;6(12):885-7.

3 楊慎先，萬大國.瑞舒伐他汀對(duì)急性心肌梗死大鼠NF-κB和IL-6表達(dá)的影響〔J〕.心臟雜志，2011;23(4):442-5.

4 賈志梅，高 遠(yuǎn).雷米普利抑制心肌梗死大鼠非梗死區(qū)心室重構(gòu)機(jī)制探討〔J〕.中國藥理學(xué)通報(bào)，2007;23(12):1676-7.

5 魏 群，楊 杰.雷米普利對(duì)心肌梗死后心衰大鼠非梗死區(qū)膠原的抑制作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010;30(2):350-2.

6 Zhuo L，Li F.Cardioprotective effects of Guanxinshutong(GXST)against myocardial ischemia/reperfusion injury in rats〔J〕.J Geriatr Cardiol，2012;9(1):130-6.

7 Maier HJ，Schips TG.Cardiomyocyte-specific ⅠκB kinase(IKK)/NF-κB activation induces reversible inflammatory cardiomyopathy and heart failure〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2012;109(29):11794-9.