雷帕霉素聯合熱療對T24細胞體外生物學行為的影響及相關機制

孟 勇 回學軍(白山市中心醫院，吉林 白山 34300)

膀胱腫瘤的生物學行為之一是腫瘤多中心性、呈多點灶狀分布，造成腫瘤易復發、轉移〔1〕。熱灌注化療可充分發揮熱療和化療的協同作用，提高膀胱腫瘤的治療效果。本研究應用T24細胞為靶點，觀察雷帕霉素聯合熱療對T24細胞的生物學行為，為人膀胱癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌T24細胞株，吉林省腫瘤研究所惠贈，雷帕霉素為美國Wyeth公司產品，MTT試劑，RPMI1640培養基購于Sigma公司，胎牛血清購于長春生物制品研究所。

1.2 MTT比色法 取對數生長期的人膀胱癌T24細胞，調細胞數為2×105/ml，接種于96孔塑料培養板內100 μl/孔，當細胞生長達到80%匯合時分組，熱療組43℃ ±0.2℃持續加熱40 min，然后移入37℃、5%二氧化碳培養箱內靜止培養。根據預實驗結果，雷帕霉素最佳劑量為10 μg/ml，聯合組在單純熱療條件下再加雷帕霉素10 μg/ml，然后移入37℃、5%二氧化碳培養箱內靜止培養24 h，于結束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續培養6 h后，吸棄上清加入二甲基亞砜150 μl/孔，震蕩10 min，使MTT還原產物完全溶解，于酶標儀570 nm處測量各孔吸光度A值，按下列公式計算T24細胞增殖抑制率〔(1－加藥孔細胞A值÷對照孔細胞A值)×100%〕。

1.3 流式細胞術 細胞培養及分組同1.2，不同之處是將96孔培養板改為25 ml培養瓶，培養結束后細胞經0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，PBS洗2次，70%冷乙醇固定。上機前過40目網，調細胞數為1×106/ml，PI染色，流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 MTT結果 不同條件對T24細胞的增殖抑制率均有影響，與對照組相比差異顯著，且聯合組效果最明顯。見表1。

2.2 流式細胞術結果 不同條件對T24細胞周期各時相均有影響，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞相對增多，細胞凋亡率升高，尤其是聯合組改變明顯。見表2。

表1 不同條件對T24細胞的增殖抑制率(s)

表1 不同條件對T24細胞的增殖抑制率(s)

組別 A值 抑制率(%)P值1.53±0.13 － －熱療組 1.24±0.16 19.1 ＜0.01雷帕霉素組 1.12±0.18 26.8 ＜0.01聯合組對照組0.78±0.11 49.1 ＜ 0.01

表2 不同條件T24細胞周期各時相及凋亡率( s，%)

表2 不同條件T24細胞周期各時相及凋亡率( s，%)

與對照組比較:1)P＜0.05;2)P＜0.01

33.5±2.3 63.4±3.1 3.1±1.6 1.5熱療組 46.2±4.11)39.4±4.42)14.4±1.92) 10.92)雷帕霉素組 50.6±4.42)29.7±3.72)19.6±3.22) 13.62)聯合組 63.7±3.52)13.1±2.32)23.2±3.52) 17.32)凋亡率對照組組別 G0/G1 S G2/M

3 討論

近年來，熱療因其安全有效而逐漸成為繼手術、放療、化療及生物治療后又一腫瘤治療手段。新近研究表明，熱療配合放療或化療可顯著提高腫瘤的局部控制率及患者的生存率〔2〕。文獻報道〔3〕，S期細胞對熱敏感，受熱后損傷嚴重，可形成多核細胞，分裂后死亡。RPM是從吸水性鏈霉菌發酵液中提取出來的大環內酯類抗生素，具有良好的抗腫瘤作用。研究證明RPM主要阻斷腫瘤細胞周期G1期，且具有良好的抑制腫瘤細胞生長的作用〔4〕，影響細胞的DNA合成，阻止G1期向S期轉化進程，造成G1期細胞增多，不能進入S期。根據流式細胞儀結果可以初步認為熱療與RPM聯合應用既能抑制細胞周期G1期的進程，又能抑制S期細胞，從而使G2/M期細胞增多，而G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反應〔5〕。

綜上，熱療與化療具有協同作用，熱療可使細胞膜的通透性和流動性改變，從而導致細胞內環境發生變化〔6〕，有利于抗腫瘤藥物吸收，促進藥物進入腫瘤細胞，充分發揮其抗癌作用。

1 雷 鳴，崔書中，巴明臣.熱灌注化療治療膀胱癌的研究進展〔J〕.實用醫學雜志，2012;28(2):169-71.

2 韓成敏，李青山，孫 冬，等.士貝母制劑聯合熱療誘導Tca8113細胞凋亡及其對細胞周期進程影響〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(3):299-301.

3 Brtek J，Lukas J.Mammalian G1 and S-phase checkpoints in response to DNA damage〔J〕.J Curr Opin Cell Biol，2001;13(6):738-47.

4 Hansel DE，Platte A，Orloff M，et al.Mammalian target of rapamycin(m TOR)regulates cellular proliferation and tumor growth in urothelial carcinoma〔J〕.Am J Pathol，2010;176(6):3062-72.

5 Eillnger-Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔M〕.Genes Celss，2000;5(6):491-8.

6 Lim CU，Zhang Y，Fox MH，et al.Cell cycle dependent apoptosis and cell cycle blocks include by hyperthermia in HL-60 cells〔J〕.Int J Hyperthermia，2006;22(1):77-91.