葛根素、甲鈷胺聯(lián)合用藥對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的作用機(jī)制

胡明財(cái) 章 卓 劉 劍 李曉冰 羅健華 李萬(wàn)平

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州 646000)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，據(jù)報(bào)道在糖尿病患者中伴有DPN和自主神經(jīng)病變約占60%〔1〕。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)葛根素合用甲鈷胺治療DPN的療效觀察報(bào)道較多，療效也較肯定，但兩藥聯(lián)用的相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)著重觀察葛根素和甲鈷胺及兩藥合用對(duì)大鼠DPN的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，重量在200～230 g左右，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(渝)20070006由重慶滕鑫動(dòng)物公司提供。注射用葛根素由華北制藥集團(tuán)制劑有限公司生產(chǎn)，每支0.2 g產(chǎn)品批號(hào):09090704;甲鈷胺注射液由重慶藥友制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，1 ml;0.5 mg產(chǎn)品批號(hào)0910010;鏈脲佐菌素(STZ)美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品批號(hào)HO250;95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國(guó)內(nèi)試劑公司生產(chǎn)，分析純。超氧化物歧化酶(SOD)與丙二醛(MDA)試劑盒及鈉鉀(Na+-K+)ATP酶試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 羅氏活力型血糖儀(ACCU-CHEK?Active)Ⅰ型，美國(guó)羅氏ACCU-CHEK公司血糖測(cè)試條;紫外分光光度計(jì)(DMS200，UVVISIBLE Spectrophotometer，Varian，美國(guó));RM6240生理機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，成都儀器廠;磁力攪拌器791型，南匯電訊器材廠。

1.3 造模及給藥 大鼠后適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)和糖尿病模型組(70只)，造模前禁食12 h，(STZ以pH4.2，0.1%枸櫞酸新鮮配制配制)，腹腔注射(55 mg/kg);正常對(duì)照組僅注射同等量的枸櫞酸緩沖液。72 h后將大鼠斷尾測(cè)血糖值，篩選血糖＞16.7 mmol/L大鼠為成模。取成功制得模型的62只大鼠，隨機(jī)分組為4組，單用甲鈷胺組、單用葛根素組、甲鈷胺和葛根素合用組和不給藥的模型組。每組10只。劑量計(jì)算參考藥理實(shí)驗(yàn)劑量體表面積比值法〔2〕，均為早上定時(shí)注射給藥，左右下腹注射交替進(jìn)行，正常組每天同時(shí)注射等體積生理鹽水，連續(xù)給藥8 w。

1.4 血糖測(cè)定 造模后72 h以及給藥后2、4、8 w后，取尾部末梢空腹血1滴用羅氏試紙配合血糖儀檢測(cè)血糖。

1.5 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SNVC)的測(cè)定 連續(xù)給藥8 w后，于禁食后12 h處理動(dòng)物。首先給予大鼠1%戊巴比妥鈉(25 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯臥位固定。切開(kāi)皮膚，分離股四頭肌肉組織至坐骨切跡，分離坐骨神經(jīng)，過(guò)程中注意用甘油保護(hù)坐骨神經(jīng)，用玻璃分針將坐骨神經(jīng)輕輕拉起，以鉤狀電極作為刺激電極置于坐骨切跡處，踝部和足底第二趾間分別插入白色記錄針電極，一對(duì)紅色參考電極置于記錄電極和刺激電極之間，大約位于腓腸肌處。測(cè)試時(shí)保持肌體溫度在37℃左右。并連接RM6240生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，選擇肌肉神經(jīng)實(shí)驗(yàn)-神經(jīng)干興奮傳導(dǎo)速度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)定:模式細(xì)電壓;方式單刺激;延時(shí)5.0;波寬0.05 ms;強(qiáng)度1.0 V;波間隔99。記錄近、遠(yuǎn)端坐骨神經(jīng)產(chǎn)生動(dòng)作電位的潛伏期，測(cè)定兩記錄電極間的距離。神經(jīng)傳導(dǎo)速度=記錄電極之間的距離/動(dòng)作電位潛伏期之差，重復(fù)電刺激三次取平均值。

1.6 坐骨神經(jīng)組織SOD、MDA及Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定SNVC測(cè)定后，取大鼠坐骨神經(jīng)組織，并準(zhǔn)確稱取坐骨神經(jīng)的重量，按重量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性、硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量;鈉鉀ATP酶的測(cè)定，具體操作方法按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 血糖濃度測(cè)定結(jié)果 注射STZ前大鼠空腹血糖水平均在(4.8±0.21)mmol/L。注射 STZ后 72 h，以空腹血糖 ＞16.7 mmol/L為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。并于造模后2、4、8 w末分別檢測(cè)血糖水平。甲鈷胺組和模型組血糖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(P＞0.05)，葛根素組、合用組與模型組之間的血糖水平有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠造模后不同時(shí)間空腹血糖濃度(mmol/L， s，n=10)

表1 大鼠造模后不同時(shí)間空腹血糖濃度(mmol/L， s，n=10)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

4.86±0.18 4.93±0.16 5.03±0.15 4.87±0.19模型組 20.78±1.931) 21.26±1.711) 23.64±1.881) 24.5±1.741)甲鈷胺組 21.31±1.81) 22.78±1.971) 23.17±1.891) 21.21±1.141)葛根素組 20.45±1.121) 19.51±1.641)18.90±1.311)2)18.44±0.881)2)甲+葛組 21.63±0.721) 20.47±0.851)19.43±0.911)2)18.50±0.921)2)72 h 2 w 4 w 8 w對(duì)照組組別

2.2 各組SNVC比較 與對(duì)照組〔(49.36±5.62)m/s〕相比，各用藥組大鼠SNVC均減慢(P＜0.05);與模型組〔(20.97±3.57)m/s〕相比各組大鼠SNVC均有提高(P＜0.05)，以合用組〔(39.17±3.36)m/s〕效果為最好;甲鈷胺組〔(37.58±4.81)m/s〕與合用組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，甲鈷胺和葛根素組〔(25.20±2.94)m/s〕相比有顯著性差異(P＜0.05)。

2.3 坐骨神經(jīng)組織SOD/MDA/Na+-K+-ATP酶的測(cè)定 模型組坐骨神經(jīng)組織 SOD含量與對(duì)照組比較明顯降低(P＜0.01)。甲鈷胺組SOD升高最明顯，合用組與甲鈷胺組作用接近，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與對(duì)照組比較，各組MDA均顯著升高(P＜0.01);與模型組相比，各用藥組大鼠MDA均顯著降低，以合用組降低較明顯(P＜0.01)。模型組大鼠Na+-K+-ATP酶活性比對(duì)照組明顯降低(P＜0.05);各治療組均可升高Na+-K+-ATP酶活性，聯(lián)合用藥組作用最明顯。見(jiàn)表2。

表2 大鼠坐骨神經(jīng)組織SOD、MDA、Na+-K+-ATP酶的含量(n=10，s)

表2 大鼠坐骨神經(jīng)組織SOD、MDA、Na+-K+-ATP酶的含量(n=10，s)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 Na+-K+-ATP酶(μmolPi/mg·h)MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)0.86±0.14 1.69±0.72 408.53±73.4模型組 0.37±0.081) 2.95±0.481) 204.47±31.451)甲鈷胺組 0.75±0.152) 2.05±0.841) 319.36±45.42)葛根素組 0.43±0.12 1.93±0.672) 288.53±87.42)甲+葛組 0.78±0.212) 1.84±0.842) 304.25±64.62)對(duì)照組

3 討論

多元醇通路代謝增強(qiáng)是引起DPN發(fā)生的重要機(jī)制〔3〕。醛糖還原酶是多元醇代謝異常所涉及的關(guān)鍵酶，其活性增高可使多元醇通路激活，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)山梨醇等滲透壓物質(zhì)增多，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，引起周圍神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的損傷改變;通過(guò)繼發(fā)機(jī)制還可增加氧自由基的生成、干擾一氧化氮的合成、提高非酶糖基化反應(yīng)水平、引起神經(jīng)組織“偽缺氧”、降低Na+-K+-ATP酶活性以及減慢神經(jīng)傳導(dǎo)速度等，導(dǎo)致血管和神經(jīng)細(xì)胞功能障礙及神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的改變〔4，5〕。

甲鈷胺〔6〕是維生素B12的衍生物，可順利地滲入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)、磷脂的生物合成，使髓鞘形成和突觸再生，修復(fù)受損的神經(jīng)纖維，提高傳導(dǎo)速度。葛根素注射液是豆科植物葛根中提取的單體一異黃酮化合物，研究發(fā)現(xiàn)〔7～10〕葛根素可改變血流動(dòng)力，降低血液黏度，抑制血小板聚集，減少血漿纖維蛋白原含量;改善微循環(huán)，增加神經(jīng)的血氧供應(yīng);改善代謝，抑制醛糖還原酶活性，減少三梨醇、果糖生成，抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化水平等。

本研究結(jié)果表明葛根素和甲鈷胺合用不僅可明顯提高糖尿病大鼠SNVC，同時(shí)也可降低大鼠血糖水平，減少神經(jīng)組織自由基生成，改善多元醇代謝，減輕坐骨神經(jīng)組織病理?yè)p害，從而產(chǎn)生良好的協(xié)同作用。其可能的機(jī)制與抑制體內(nèi)自由基生成，減輕氧化應(yīng)激損傷、改善多元醇代謝從而減輕神經(jīng)組織病理?yè)p傷有關(guān)。

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