雞血藤總黃酮對酒精性肝損傷的保護作用及機制

亢澤春 劉少華 高 聰(濱州醫學院，山東 煙臺 264003)

酒精性肝病是一進行性疾病，早期的病理改變為肝細胞氧化損傷，一旦發展到晚期則難以逆轉和治愈。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗氧化、解酒等作用〔1，2〕。相關研究表明〔3〕，雞血藤提取物總黃酮有抗氧化及保肝作用。本實驗以雞血藤總黃酮作為解酒及保肝劑，在構建小鼠酒精性肝損傷模型基礎上，觀察雞血藤總黃酮的解酒及保肝作用。

1 材料與方法

1.1 動物 健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重(25±2)g，濱州醫學院動物實驗中心提供(許可證號:20100009)。

1.2 試劑 雞血藤總黃酮(濱州醫學院藥物研究所提供，含量85%)，56%(v/v)二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號20101211、20101208、20101112;氯化鈉注射液(山東科倫藥業有限公司，批號091130);無水乙醇(煙臺三和化學試劑有限公司，批號090730)。

1.3 儀器 IR16-A高速冷凍離心機(北京雷勃爾離心機有限公司)，UV757CRT紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，HH-4數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，BS-200全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及給藥 取小鼠60只，適應性喂養3 d后隨機分為5組:空白組、模型組、雞血藤總黃酮低、中、高劑量組，每組12只。空白組給予生理鹽水20 ml/kg，1次/d，雞血藤總黃酮劑量分別為0.1、0.2、0.4 g/kg;模型組20 ml/kg生理鹽水。均連續灌胃給藥7 d。

1.4.2 急性酒精性肝損傷造模 除空白組外，其余各組均在末次給藥1 h后，一次性給予56%(v/v)的紅星二鍋頭酒10 ml/kg。空白組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.4.3 指標測定及方法 記錄小鼠的耐受酒精時間(從灌酒到翻正反射消失)和醉酒時間(從翻正反射消失到翻正反射重新開始)，比較各組間的差異。小鼠禁食16 h后，摘除眼球取血，離心血清，應用BS-200全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，天冬氨酸氨基轉移酶(AST)，總膽紅素(TB)含量。取小鼠肝臟，用冷生理鹽水沖洗后制備勻漿，離心后取上清，測定SOD，GSH-Px及MDA活性，參照試劑盒說明書操作。取小鼠肝臟，用10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察。取小鼠肝臟，胰酶消化后低溫高速離心機離心得肝細胞，流式細胞術測肝細胞線粒體膜電位。取10%肝組織勻漿，低溫低速離心沉淀后，將上清低溫高速離心15 min，得沉淀即為線粒體，參照文獻方法測定線粒體呼吸鏈酶復合體?+ó、ò+ó活性。

1.5 統計學方法 應用SPSS12.1統計軟件，計量資料以s表示，組間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 對小鼠酒精耐受時間和醉酒昏睡時間的影響 高劑量雞血藤總黃酮組小鼠酒精耐受時間較模型組增高，差異有統計學意義(P＜0.05)。而低、中劑量組與模型組相比，差異無統計學意義(P＞0.05);雞血藤總黃酮各劑量組均可明顯縮短醉酒時間(P＜0.01)。見表1。

2.2 對酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響 與空白組相比，模型組小鼠ALT，AST，TB含量均明顯升高(P＜0.01);雞血藤總黃酮高、中劑量組ALT，AST，TB含量與模型組相比明顯降低(P＜0.01)。見表2。

表1 雞血藤總黃酮對小鼠醉酒時間和耐受時間的比較( s，n=12，min)

表1 雞血藤總黃酮對小鼠醉酒時間和耐受時間的比較( s，n=12，min)

與模型組比較:1)P＜0.01

耐受時間 醉酒時間空白組組別 死亡數(n)0--模型組 4 13.10±3.13 156.63±16.12雞血藤總黃酮高劑量組 3 23.25±5.751)112.22±14.291)雞血藤總黃酮中劑量組 2 19.33±11.05 124.90±13.73雞血藤總黃酮低劑量組4 18.45±8.07 132.50±14.74

表2 雞血藤總黃酮對酒精性肝損傷小鼠血清肝功能指標的影響( s，n=12)

表2 雞血藤總黃酮對酒精性肝損傷小鼠血清肝功能指標的影響( s，n=12)

與空白組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01，下表同

組別 ALT(IU/L)AST(IU/L)TB(μmol/L)34.69±10.81 49.57±15.23 9.21±4.07模型組 208.02±25.061)452.60±157.811)55.67±24.461)雞血藤總黃酮高劑量組 100.74±11.172)213.37±90.272)30.88±12.362)中劑量組 135.86±32.272)320.64±104.512)37.19±9.542)低劑量組空白組197.78±20.01 387.16±125.29 49.23±20.03

2.3 對酒精性肝損傷小鼠肝組織氧化應激指標的影響 模型組SOD，GSH-Px活性和 MDA水平與空白組相比，差異顯著(P＜0.01)。與模型組相比，雞血藤總黃酮中、高劑量組SOD，GSH-Px活性明顯升高(P＜0.01)，MDA水平明顯降低(P＜0.01)。見表3。

2.4 對小鼠肝臟組織學病理變化的影響 光鏡下觀察到空白組小鼠肝組織結構完整、清晰，肝小葉結構正常;模型組可見肝索紊亂、胞質疏松，胞質內可見大小不一的脂滴空泡，竇內皮細胞腫脹、增生，匯管區有炎細胞浸潤，肝小葉出現點狀壞死;雞血藤總黃酮各給藥組小鼠肝組織也見肝細胞變化，但程度較模型組明顯減輕。見圖1。

表3 雞血藤總黃酮對酒精性肝損傷小鼠氧化應激的影響( s，n=12)

表3 雞血藤總黃酮對酒精性肝損傷小鼠氧化應激的影響( s，n=12)

組別SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)MDA(nmol/mg)193.68±21.20 12.98±3.21 3.18±0.61模型組 92.20±10.401)6.62±2.831)10.49±2.051)雞血藤總黃酮高劑量組 180.54±17.172)11.44±4.452)6.73±1.102)雞血藤總黃酮中劑量組 162.45±18.132)9.22±2.072)7.94±1.122)雞血藤總黃酮低劑量組空白組109.04±25.07 7.39±2.75 9.01±1.59

圖1 雞血藤總黃酮對酒精性肝損傷小鼠肝組織形態學的影響(HE，×400)

2.5 對小鼠線粒體酶和線粒體膜電位的影響 與空白組相比，模型組小鼠呼吸鏈酶復合體?+ó、ò+ó活性顯著下降(P＜0.01)。與模型組相比，雞血藤總黃酮高中劑量組能明顯提高小鼠呼吸鏈酶復合體?+ó、ò+ó活性(P＜0.01)。與空白組相比，模型組小鼠線粒體膜電位明顯下降(P＜0.01)。與模型組相比，雞血藤總黃酮高、中劑量組小鼠線粒體膜電位明顯升高(P＜0.01)。見表4。

表4 雞血藤總黃酮對酒精性肝損傷小鼠線粒體酶和線粒體膜電位的影響( s，n=12)

表4 雞血藤總黃酮對酒精性肝損傷小鼠線粒體酶和線粒體膜電位的影響( s，n=12)

組別 ?+ó ò+ó Δψm 11.68±1.21 21.93±2.33 1.00±0.09模型組 2.29±0.141) 4.26±0.831) 0.35±0.021)雞血藤總黃酮高劑量組 10.54±1.172) 11.44±4.452) 0.89±0.062)雞血藤總黃酮中劑量組 6.24±0.832) 9.22±2.072) 0.78±0.032)雞血藤總黃酮低劑量組空白組3.04±0.07 7.39±2.75 0.49±0.04

3 討論

長期大量酒精攝入引起酒精性肝病的發生，其發病機制尚不清楚。近年來，學術界普遍認為氧化應激在酒精性肝損傷中起著重要的作用。而引起肝損傷的氧化應激是由自由基所誘導。自由基通過激活膜上的磷酸化酶或者攻擊肝細胞膜上的磷脂分子而使細胞發生脂質過氧化反應，也可通過與肝微粒體上的脂質和蛋白質共價結合而損傷膜結構。而脂質過氧化反應也會導致線粒體細胞膜損傷，線粒體膜電位下降，線粒體內酶活性下降〔4～6〕。SOD是重要的分布于生物體內的抗氧化酶，發揮清除體內氧自由基，防止細胞結構損傷的作用，SOD活性大小反映自由基的清除速度。MDA是脂質過氧化反應的終末產物，反映脂質過氧化程度，間接反映肝損傷的程度〔7〕。GSHPx反映機體抗氧化能力，它和SOD，過氧化氫酶(CAT)共同清除體內的活性氧，從而減輕和阻止活性氧的損傷作用〔8〕。GSHPx不僅能清除過氧化氫和氫過氧化物，而且能夠使脂質過氧化物(LPO)變成無毒的羥化物，防止細胞膜和其他細胞器免受過氧化損傷。本實驗說明應用雞血藤總黃酮后，小鼠的肝氧化損傷程度減輕，雞血藤總黃酮對乙醇所致肝損傷有保護作用。ALT，AST是判斷肝損傷的重要標志。本實驗證實，應用雞血藤總黃酮后，ALT，AST，TB水平較模型組明顯下降，進一步證實了雞血藤總黃酮的保肝作用。通過測定線粒體膜電位，觀察線粒體的完整性。而線粒體呼吸鏈上復合體的活性決定了線粒體的產能情況。復合體?和ó是電子傳遞入口，而復合體ó向下傳遞電子并伴隨能量的產生，故復合體?+ó和復合體ò+ó活性反映線粒體的功能。該實驗中雞血藤總黃酮可提高線粒體膜電位并增強肝線粒體酶復合體?+ó、ò+ó活力。而雞血藤總黃酮對線粒體的保護作用又可能是由于其抑制脂質過氧化反應，增強內源性抗氧化酶的活性，減少活性氧的產生。但雞血藤總黃酮保肝作用機制是否是與線粒體通路有關還有待于進一步研究。

1 謝 玲，黃海瀟，張 浩，等.基于抗氧化反應元件的藥物篩選模型的建立〔J〕.中國藥理學通報，2006;22(12):1525.

2 Chow JM，Shen SC，Huan SK，et al.Quercetin，but not rutin and quercitin，prevention of H2O2-induced apoptosis via antioxidant activity and heme oxygenase 1 gene expression in macrophages〔J〕.Biochem Pharmacol，2005;69:1839.

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5 楊明杰，周建嫦，黃俊明，等.酒精性肝病發生機制研究進展〔J〕.中國公共衛生，2003;19(3):367.

6 劉 爽，姚 平，李 珂，等.槲皮素對大鼠原代肝細胞酒精性氧化損傷的防護作用〔J〕.營養學報，2007;29(3):288.

7 潘春芬，肖秀華，田恩圣，等.雞血藤體外對肝勻漿MDA生成及蛋白質糖基化作用〔J〕.中華醫學全科雜志，2004;3(3):26.

8 黃鎖義，羅建華，張麗丹，等.雞血藤總黃酮的提取及對羥自由基的清除作用研究〔J〕.時珍國醫國藥，2007;18(9):3.