野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠肝細胞蛋白合成及小鼠免疫功能的影響*

畢躍琴，葉玉廷，王洋洋，孫軼群，王 盼，阿有梅，畢躍峰#

1)南陽市骨科醫院藥械科 南陽473000 2)鄭州大學藥學院 鄭州450001

野菊花(Flos Chrysanthemi indici) 來源于菊科植物野菊的干燥頭狀花序[1]，性微寒，味苦辛，歸心肝二經，具有疏風清熱解毒的功效。近年來研究[2]表明野菊花對肝具有一定的保護作用。作者在前期研究[3-5]中發現野菊花的主要活性成分為萜類(以倍半萜為主)和黃酮類化合物，并通過工藝研究得到了3個萃取部位的提取物及其主要成分：FCI-A主要含萜類化合物，FCI-B富含萜類和黃酮類化合物，FCI-C主要含總黃酮化合物。作者觀察了野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠肝細胞蛋白合成及小鼠免疫功能的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑與儀器SPF級昆明種小鼠，雄性，體質量(20±2) g，由河南省實驗動物中心提供。野菊花采自河南省信陽大別山地區，經鄭州大學藥學院潘成學副教授鑒定為菊科植物野菊花的干燥頭狀花序，標本存于鄭州大學藥學院標本室，標本號201110。野菊花不同萃取部位FCI-A、FCI-B和FCI-C浸膏由作者所在實驗室自行制備。羧甲基纖維素鈉(分析純)購自天津市科密歐化學試劑有限公司，1,2-丙二醇(分析純)購自天津市風船化學試劑科技有限公司，D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-galn)購自美國Sigma公司，聯苯雙酯滴丸(bifendate pill，BP) 購自浙江萬邦藥業有限公司。總蛋白(total protein，TP)測試盒、白蛋白(albumin，ALB)測試盒和谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase， ALT)測試盒均購自南京建成生物工程研究所。CP214電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)，UV-2550分光光度計(日本Shimadzu公司)，Herolab UniCen MR離心機(德國Herolab公司)，318C Microplate Reader 雙波長酶標儀(上海三科儀器有限公司)。

1.2藥物配制FCI-A、FCI-B、FCI-C以及陽性藥物BP以1,2-丙二醇和DMSO溶解后，添加10 g/L羧甲基纖維素鈉，各組藥物均含體積分數20%丙二醇和體積分數1% DMSO。所有藥物均現配現用。

1.3野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠肝細胞蛋白合成的影響各組高、中、低劑量設計根據各部位毒性試驗確定。96只雄性昆明種小鼠隨機分為12組，每組8只，分別為正常組，模型組，FCI-A低、中、高劑量組(分別給予0.5、1.0、2.0 g/kg)、FCI-B低、中、高劑量組(分別給予0.75、1.50、3.00 g/kg)、FCI-C低、中、高劑量組(分別給予1.0、2.0、4.0 g/kg)，BP組(0.2 g/kg)。各給藥組按0.02 mL/(g·d)劑量灌胃給藥，正常組和模型組給予相應體積的溶媒，連續灌胃給藥7 d。于末次給藥1 h后，除正常組腹腔注射等量生理鹽水外，其余各組均腹腔注射100 g/L D-galn(0.8 g/kg)，禁食不禁水，24 h后小鼠稱質量，眼靜脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清,按照測試盒說明分別測定TP、ALB水平及ALT活性。頸椎脫臼處死各組小鼠，快速摘取肝、脾，生理鹽水洗去血跡，濾紙拭干，用分析天平稱取質量，計算肝、脾指數[6]。

1.4野菊花不同萃取部位對小鼠免疫功能的影響

1.4.1 小鼠碳粒廓清實驗 另取88只小鼠隨機分為11組，每組8只。空白組，陽性對照組[醋酸潑尼松0.02 mg/(g·d)]，FCI-A、FCI-B及FCI-C低、中、高劑量組分別按 1、3、6 mg/(g·d)灌胃給予相應藥物，連續7 d。末次給藥1 h后，尾靜脈注射印度墨水0.01 mL/g，于2 min和10 min后眼眶取血20 μL，加入2 mL 1 g/L Na2CO3溶液中，于630 nm處測吸光度值。常規方法計算廓清指數、吞噬指數。

1.4.2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗 再取64只小鼠隨機分為8組，每組8只，FCI-B低、中、高劑量組，FCI-C低、中、高劑量組，空白組和陽性對照組同1.4.1中處理，連續7 d。實驗前48 h腹腔注射0.5 mL 10 g/L溶解淀粉作為小鼠腹腔巨噬細胞的誘導物。末次給藥1 h后，每只小鼠腹腔注射體積分數2%的雞紅細胞懸液1 mL，輕揉腹部，使細胞液分散。間隔30 min處死小鼠。正中剪開腹壁皮膚，腹腔注射生理鹽水2 mL,轉動鼠板1 min。吸出1 mL腹腔液, 分別滴于兩片載玻片上，置37 ℃恒溫箱內30 min。以冰丙酮/甲醇(VV=11)固定15 min。40 g/L Giemsa染液染色3 min，蒸餾水漂洗，晾干。油鏡下鏡檢，計數吞噬雞紅細胞的巨噬細胞及被吞噬的雞紅細胞總數，常規方法計算吞噬率和吞噬指數。

1.5統計學處理采用SPSS 17.0處理數據。應用單因素方差分析比較各組小鼠肝、脾指數和血清TP、ALB水平及ALT活性及各免疫指標的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠肝、脾指數的影響模型組小鼠肝、脾指數較正常組升高，而野菊花不同萃取部位組小鼠肝、脾指數較模型組不同程度地降低，其中FCI-A、FCI-B高劑量組小鼠肝、脾指數明顯降低，而FCI-C組小鼠脾指數明顯降低，趨于正常。見表1。

表1 野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠肝、脾指數的影響 %

#:與正常組相比，P<0.05；*:與模型組相比，P<0.05。

2.2野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠血清TP、ALB水平及ALT活性的影響模型組小鼠血清TP、ALB水平較正常組降低，ALT活性升高，而FCI-A和 FCI-B組小鼠血清TP、ALB水平較模型組升高，以FCI-B組更明顯(P<0.05)。見表2。

表2 野菊花不同萃取部位對肝損傷小鼠血清TP、ALB水平及ALT活性的影響

#: 與正常組相比，P<0.05；*:與模型組相比，P<0.05。

2.3野菊花不同萃取部位對小鼠體內碳粒廓清功能的影響碳粒廓清實驗結果顯示FCI-B、FCI-C對吞噬指數有影響，FCI-A對吞噬指數無明顯影響。見表3。

表3 野菊花不同萃取部位對小鼠體內碳粒廓清功能的影響

*:與空白組比較，P<0.05。

2.4野菊花不同萃取部位對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響與空白組比較，FCI-B、FCI-C低劑量組巨噬細胞吞噬指數升高，高劑量組巨噬細胞吞噬指數降低。見表4。

表4 野菊花不同萃取部位對巨噬細胞吞噬功能的影響

*:與空白組比較，P<0.05。

3 討論

肝臟是機體重要的代謝器官，在糖、脂類與蛋白質等代謝中均有重要作用[7-8]。蛋白質在機體內具有運輸、營養、凝血與抗凝血、免疫作用以及維持pH值與血液滲透壓等生理功能[9]。D-galn為肝細胞毒劑，競爭性與磷酸尿苷結合而抑制肝細胞核酸、糖蛋白與脂糖等的合成，從而使肝細胞受損。大劑量D-galn可引起嚴重的肝細胞損傷，且該損傷的病理學特征與人類病毒性肝炎極為相似[10]。現代醫學表明肝損傷時，肝血竇內淤血，中央靜脈回流受阻，門靜脈內壓升高，可致脾臟充血，腫大，繼發脾功能亢進。由此可見肝臟病變可波及脾，所以除肝指數外，該研究同時選取了脾指數作為檢測指標。該實驗結果顯示，FCI-A、FCI-B可不同程度地降低肝損傷小鼠肝、脾指數，特別是脾指數，保護受損肝、脾組織。

血清內主要的蛋白質幾乎全部由肝臟制造，故測定血清蛋白的水平并分析其成分，可了解肝臟合成功能的狀態。肝臟合成的蛋白主要為ALB及大部分α、β球蛋白。急、慢性肝損傷時，血清TP濃度都會減少，但慢性損傷時，γ球蛋白常升高，致使TP水平變化不大，故單憑血清TP水平難以正確估測肝臟合成功能。肝臟合成ALB呈限速性，僅在體內過量ALB丟失或被破壞的情況下，其合成速率才會增加。ALB一旦在肝細胞粗面內質網合成后，便經高爾基體分泌入肝竇。肝損傷時，ALB的合成、細胞內運輸和釋放發生障礙，進而引起血清ALB減少[11]。該實驗中，FCI-A和FCI-B可以不同程度地提高肝損傷小鼠血清TP、ALB水平，尤以FCI-B作用更明顯，而FCI-C對提高肝損傷小鼠蛋白合成能力作用不明顯，提示增強肝蛋白合成功能的主要活性成分可能為萜類化合物，而黃酮類對其有一定的協同作用，值得進一步研究。

ALT正常存在于肝細胞胞質中，當肝細胞發生壞死，細胞膜破裂或肝細胞變形，細胞膜通透性增高時，血清ALT活性升高。ALT活性可反映肝細胞變性、壞死程度，為檢查肝功能損害的一個靈敏指標[12]。該研究中，FCI 3個萃取部位某些劑量在一定程度上能降低肝損傷小鼠血清ALT活性。

小鼠體內碳粒廓清、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗都是機體固有免疫功能的檢測指標。小鼠體內碳粒廓清實驗顯示FCI-A對其影響較小，故巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗只測了FCI-B、FCI-C。實驗結果顯示，低劑量的FCI-B、FCI-C均能提高吞噬指數，高劑量FCI-B、FCI-C可降低吞噬指數，說明FCI-B、FCI-C對免疫具有雙向調節作用。關于免疫調節的量效關系，尚需進一步深入研究。

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