半邊旗提取物5F對乳癌細胞MDA-MB-231培養物誘導的HUVEC血管生成潛能的影響*

何振輝，翁閃凡，何太平，覃燕梅，梁念慈

1)佛山科學技術學院醫學院醫學檢驗系 佛山 528000 2)廣東醫學院生物化學與分子生物學研究所 湛江 524023 3)廣東省天然藥物研究與開發重點實驗室 湛江 524023

半邊旗(PterissemipinnataL, PsL)又名半邊蕨、半邊梳，為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物，廣泛分布于南方各省，民間常用于清熱解毒、消腫止痛。5F是作者所在的課題組從PsL中提取的二萜類化合物，化學名為11α-羥基-15-氧-16-烯-ent-貝殼杉烷-19酸，分子式為C20H28O4，相對分子質量為332.4。以往的研究[1-2]表明，5F能誘導多種腫瘤細胞凋亡，具有較強的抗腫瘤活性。何太平等[3-4]發現5F影響高轉移卵巢癌細胞HO-8910PM多種癌相關基因尤其是P53、Nr1d1的表達。作者以人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為受試對象，研究5F對高轉移乳癌細胞MDA-MB-231培養物誘導的HUVEC血管生成潛能的影響，并分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料HUVEC、MDA-MB-231細胞分別購自美國Cascade Biologics公司和美國典型培養物保藏中心。小牛血清購自杭州四季青公司，MTT購自Amresco公司，DMEM培養基購自Gibco公司，PVPF濾膜(孔徑8 μm，直徑13 mm)購自Osmonics公司，Fibronectin、Matrigel購自BD公司。KDR小鼠IgG單抗、Flt-1小鼠IgG單抗、β-actin山羊IgG多抗購自Santa Cruz公司，使用時以TBST溶液按1(1 000～2 000)稀釋；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、兔抗山羊IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司，使用時以TBST溶液按1(4 000～10 000)稀釋。5F由廣東醫學院天然藥物開發中心提供，實驗前以DMSO溶解，培養液稀釋。

1.2細胞培養和乳癌細胞培養物的制備MDA-MB-231細胞、HUVEC分別培養于含體積分數10%小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養基中，37 ℃、體積分數5%CO2飽和濕度孵箱中培養。

取生長良好的MDA-MB-231，棄去培養液，加入無血清DMEM培養液繼續培養24 h, 收集上清，即為乳癌細胞培養物，過濾除菌，備用。

1.3HUVEC增殖抑制實驗采用MTT法。參照文獻[5]，選取處于對數生長期的HUVEC,確保細胞存活率在97%以上。細胞以(0.5～1.0)×105mL-1接種于96孔培養板，每孔100 μL。在37 ℃、體積分數5%CO2、飽和濕度條件下過夜，換乳癌細胞培養物后，用藥組加入1 μL不同濃度5F，使5F終濃度為10、20、40、80、160 μmol/L，每個濃度設3個平行孔，并設空白對照組、溶劑對照組及完全培養基調零孔，置孵箱中6、24 h后，每孔加入10 μL 5 g/L MTT繼續培養4 h。傾去培養液，每孔加入200 μL DMSO溶解，于酶標儀上測定波長570 nm處的吸光度。實驗重復3次。細胞增殖抑制率=(1-給藥組細胞吸光度值/對照組細胞吸光度值)×100%。

1.4乳癌細胞培養物誘導的HUVEC穿膜、趨化性運動能力測定[6]將PVPF濾膜用指甲油貼在Transwell小室上，風干；在膜的外表面涂10 μL纖連蛋白(5 μg)，置超凈臺內風干，膜的內表面涂10 μL Matrigel(5 μg)，干燥后形成人工重組基底膜。收集對數生長期的HUVEC，懸浮于1 g/L BSA-DMEM無血清培養基中，調整密度為1×109L-1。將Transwell小室浸于24孔板(每孔預先加入600 μL 乳癌細胞培養物)中，每個小室加入100 μL HUVEC懸液，同時加入20、40、80 μmol/L的5F 1 μL，對照組加入等量的PBS。37 ℃、體積分數5%CO2孵箱內孵育6 h。將Transwell小室取出，濾膜用甲醇固定1 min，蘇木素染色3 min，水洗，伊紅染色10 s，水洗，用生理鹽水浸濕的棉簽擦去濾膜內表面的細胞；用封片膠將濾膜封于載玻片上，于高倍鏡下計數穿膜細胞。每膜計數5個視野，每組平行設3個濾膜。趨化性運動能力測定與上述實驗相比，只是PVPF濾膜上不鋪 Matrigel，其余處理相同。抑制率=(1-給藥組穿膜或遷移細胞數/對照組穿膜或遷移細胞數)×100%。

1.5HUVEC基質黏附實驗96孔培養板每孔預鋪Matrigel，置超凈臺內風干后用20 g/L BSA封閉1 h，PBS沖洗；收集預先經20、40和80 μmol/L 5F處理24 h的以乳癌細胞培養物培養的HUVEC細胞，懸浮于含1 g/L BSA-DMEM培養基中，調整細胞密度為8×105mL-1，每孔加入100 μL，并設空白對照組、溶劑對照組及DMEM培養基調零孔。37 ℃培養1 h；棄培養液，以PBS輕輕沖洗3遍除去未黏附細胞；棄去PBS，每孔加入100 μL DMEM完全培養基和 50 μL 1 g/L MTT繼續培養4 h。傾去MTT，每孔加入150 μL DMSO溶解，振搖15 min，于酶標儀上測定波長570 nm處的吸光度。每組平行設3個孔，實驗重復3次。黏附抑制率= (1-給藥組黏附細胞吸光度/對照組黏附細胞吸光度)×100%。

1.6各組細胞Flt-1和KDRmRNA的檢測[7]待HUVEC貼壁生長后，加入乳癌細胞培養物，再分別加入PBS、體積分數0.1%DMSO和終濃度為20、40、80 μmol/L 5F，處理24 h后收集細胞，提取總RNA，逆轉錄為cDNA。Flt-1上游引物5’-GAC TAGATAGCGTCACCAG-3’,下游引物5’-TAAGACT GCCAAAGATGTT-3’; KDR上游引物5’-AGGGTG GAGGTGACTGAG-3’, 下游引物5’-GAGTCAGT GGAGGTGGGA-3’; GAPDH上游引物5’-TCATT GACCTCAACTACATGGTTT-3’,下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR反應體系按試劑盒說明配制，在Mx3000P實時定量熒光PCR儀上進行反應。反應條件：94 ℃變性5 min;94 ℃ 10 s,53 ℃ 20 s,72 ℃ 15 s,共循環40次。記錄各管Ct值，采用2-ΔΔCt法計算Flt-1、KDR及GAPDH mRNA的表達量,以Flt-1/GAPDH及KDR/GAPDH作為Flt-1及KDR mRNA的相對表達量。

1.7各組細胞Flt-1和KDR蛋白的檢測細胞同1.6中分組處理24 h，收集，PBS洗滌后用預冷的細胞裂解液刮下，轉移至預冷的1.5 mL離心管中，冰育30 min后，于4 ℃，12 000g離心15 min，收集上清。取少量上清用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。Western blot的方法參照《分子克隆實驗指南》，以β-actin為內參。溶劑對照組及不同劑量5F組Flt-1和KDR蛋白的相對表達量為各組相應指標與空白對照組的比值×100%。

1.8統計學處理采用SAS V8.1處理數據。采用2×7析因設計的方差分析比較處理不同時間各組細胞的增殖抑制率，余指標采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 5F對乳癌細胞培養物誘導的HUVEC增殖的抑制作用見表1。5F對乳癌細胞培養物誘導HUVEC的增殖具有一定程度的抑制作用，并且抑制率均隨濃度和時間的增加而增加。20、40、80 μmol/L的5F在6 h內對血管內皮細胞生長的抑制率均低于10%，且與空白對照組相比，差異無統計學意義，因此在考察5F對HUVEC體外穿膜和趨化性運動能力的影響時，為了排除5F自身對細胞的毒性作用，選擇20、40、80 μmol/L作為實驗濃度。

表1 5F對乳癌細胞培養物誘導的HUVEC增殖的抑制作用 (n=3)

F組間=64.852，F時間=131.393，F交互=23.266，P<0.001；*：與空白對照組相比，P<0.05;△：與空白對照組相比，P<0.01。

2.2 5F對乳癌細胞培養物誘導的HUVEC穿膜能力、趨化性運動能力及黏附基質能力的影響見圖1、2及表2。5F能明顯抑制乳癌細胞培養物誘導的HUVEC穿膜能力、趨化性運動能力及黏附基質能力。

圖1 穿膜能力實驗中黏附在PVPF膜上的HUVEC(×400)

圖2 趨化性運動能力實驗中黏附在PVPF膜上的HUVEC(×400)

表2 5F對乳癌細胞培養物誘導的HUVEC穿膜能力、趨化性運動能力及黏附基質能力的影響 (n=3) %

*：與空白對照組相比，P<0.01。

2.3 5F對乳癌細胞培養物誘導的HUVECFlt-1、KDRmRNA和蛋白表達的影響見圖3，表3、4。不同濃度的5F作用于乳癌細胞培養物誘導的HUVEC 24 h后， 細胞中Flt-1、KDR mRNA和蛋白的表達水平均下調。

表3 各處理組HUVEC KDR、Flt-1 mRNA相對表達量的比較 (n=3) ×10-4

*：與空白對照組相比，P<0.05。

圖3 5F對乳癌細胞培養物誘導的HUVEC KDR、Flt-1蛋白表達的影響

表4 各處理組HUVEC KDR、Flt-1 蛋白表達的比較 (n=3) %

*：與空白對照組相比，P<0.05。

3 討論

對于腫瘤血管生成抑制劑，一般可以用分子模型、細胞模型、組織器官模型來篩選和研究其作用機制。隨著內皮細胞培養技術的發展，血管形成的許多過程都可以用血管內皮細胞模型進行研究，如血管內皮細胞的增殖、血管內皮細胞向腫瘤組織的浸潤、運動等[8]。該研究結果顯示5F具有抑制高轉移乳癌細胞培養物誘導的HUVEC體外增殖、穿膜、趨化性運動能力和黏附基質能力。但體外有作用的物質在體內不一定有相同的作用，結合先前的研究[9]，下一步應以具體的體內實驗如構建裸鼠乳癌模型來觀察5F抗腫瘤血管生成的作用。

腫瘤血管生成的首要環節是腫瘤血管生成因子與血管生成抑制因子失衡，血管生成表型形成。在諸多血管生成因子中，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)居于中心地位[10]。VEGF與其受體結合后發揮生物學作用。目前，VEGF受體(VEGFR)已發現有5種：VEGFR-1(Flt-1), VEGFR-2(KDR/Flk-1)， VEGFR-3(Flt-4)，NP-1和NP-2。Flt-1、KDR、Flt-4均是受體酪氨酸蛋白激酶；Flt-1、KDR是VEGF的主要受體，主要在血管內皮細胞上表達, Flt-4主要存在于淋巴管內皮細胞[11]。

KDR是VEGF最重要的受體，處于信號轉導的上游。Rastelli等[12]發現VEGFR-2在VEGF所誘導的血管生成和血管通透性中起主要作用。單獨使用KDR抑制劑就能阻斷VEGF和bFGF所誘導的血管生成。VEGF能通過Grb10上調KDR的表達。活化的KDR能夠激活PI3K、PLC-γ，引起血管內皮細胞的遷移和血管通透性增加；通過黏附斑激酶和Src的相互作用，促進血管內皮細胞的增殖和運動，抑制其凋亡[13]。該實驗結果顯示5F可下調乳癌細胞培養物誘導的HUVEC中KDR mRNA和蛋白的表達，這可能是5F抑制MDA-MB-231細胞培養物(含有高分泌水平VEGF)引發的血管內皮細胞的增殖、運動、浸潤基底膜等生物學作用的原因。

在VEGFR中，Flt-1的信號轉導機制目前還未明了?；蚯贸椒@示Flt-1缺乏的小鼠死于血管生成過多。Flt-1 mRNA的剪接可產生可溶性的Flt-1(sFlt-1)。sFlt-1跟VEGF結合后，不能發生信號轉導。sFlt-1能抑制腫瘤血管生成。也有報道[14]認為Flt-1能誘導單核巨噬細胞遷移并分泌VEGF，因此Flt-1信號轉導通路能促進腫瘤生長和轉移。該實驗結果顯示5F下調MDA-MB-231細胞培養物誘導的HUVEC中Flt-1的表達，這種作用究竟是促進還是抑制HUVEC的血管生成潛能，尚待進一步研究。

總之，該研究結果顯示，5F 能抑制MDA-MB-231細胞培養物誘導的HUVEC體外增殖、穿膜、趨化性運動能力和黏附基質能力，其作用機制可能與5F下調HUVEC KDR mRNA和蛋白表達水平有關。結合課題組先前的研究[9,15]，提示5F具有開發為腫瘤血管生成抑制劑的潛能。

[1]Chen GG, Leung J, Liang NC, et al. Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid inhibits hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo via stabilizing IkBα [J]. Invest New Drugs, 2012, 30(6):2210

[2]Li MY, Liang NC, Chen GG. Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid induces apoptosis of human malignant cancer cells[J]. Curr Drug Targets, 2012, 13(14):1730

[3]何太平, 覃燕梅, 莫麗兒, 等. 半邊旗二萜類化合物5F對高轉移卵巢癌HO-8910PM細胞中癌相關基因表達的影響[J]. 中國藥理學通報, 2008，24(1)：117

[4]何太平, 吳科鋒, 呂應年, 等. 半邊旗二萜化合物5F對HO-8910PM細胞中Nr1d1表達的影響[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(10): 1268

[5]羅娟,許偉,薛天陽,等. 苦參堿對人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的作用機制[J]. 實用兒科臨床雜志，2012,27(3):190

[6]李金鋒, 豐貴文, 王躍, 等. COX-2基因沉默對OS-RC-2細胞生長和侵襲能力的影響[J]. 鄭州大學學報：醫學版, 2010, 45(6): 986

[7]鄧凡,王春霞,許萬福,等. PKD3上調前列腺癌細胞中PSA 表達及機制[J]. 南方醫科大學學報，2010,30(8):1779

[8]Bocci G, Fioravanti A, Orlandi P, et al. Metronomic ceramide analogs inhibit angiogenesis in pancreatic cancer through up-regulation of caveolin-1 and thrombospondin-1 and down-regulation of cyclin D1[J]. Neoplasia, 2012, 14(9):833

[9]何振輝, 何太平, 莫麗兒, 等. 白藜蘆醇與半邊旗二萜類化合物5F對活體血管生成的影響[J]. 實用醫技雜志, 2006, 13(1): 1

[10]何振輝，梁念慈.以VEGF和bFGF及其受體為靶點的抗腫瘤血管治療[J].國外醫學：生理、病理科學與臨床分冊, 2004, 24(2):162

[11]Shibuya M. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and Its Receptor (VEGFR) Signaling in Angiogenesis: A Crucial Target for Anti- and Pro-Angiogenic Therapies [J]. Genes Cancer, 2011, 2(12): 1097

[12]Rastelli L, Valentino ML, Minderman MC, et al. A KDR-binding peptide (ST100, 059) can block angiogenesis, melanoma tumor growth and metastasis in vitro and in vivo [J]. Int J Oncol, 2011, 39(2): 401

[13]Holmqvist K, Cross MJ, Rolny C, et al. The adaptor protein shb binds to tyrosine 1175 in vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-2 and regulates VEGF-dependent cellular migration[J]. J Biol Chem, 2004, 279(21): 22267

[14]Murakami M, Zheng Y, Hirashima M, et al. VEGFR1 tyrosine kinase signaling promotes lymphangiogenesis as well as angiogenesis indirectly via macrophage recruitment [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008, 28(4):658

[15]李立,呂應年,劉義,等. 半邊旗提取物5F誘導HepG2細胞凋亡與p53活化及血管內皮生長因子抑制有關[J]. 中草藥, 2010, 41(2): 241