鑄造鈷鉻合金含銀抗菌涂層對L929細胞增殖及凋亡的影響*

梁銳英，趙 悅，徐艷麗，吳文慧﹟，孟 賀，趙 敏

1)河北聯合大學口腔醫學院口腔修復科 唐山 063000 2)清河縣人民醫院口腔科 邢臺 054800

鈷鉻合金以其生物性能和抗腐蝕性能良好、強度和硬度高、延伸率低、耐磨性好等特點成為臨床義齒修復應用的主要材料。鈷鉻合金鑄造支架是活動義齒修復的重要組成部分，也是口腔內鏈球菌、乳桿菌、放線菌等多種條件致病菌容易沉積的位置。隨著義齒戴用時間的延長，基牙患齲率以及義齒性口炎的發生率逐漸升高，采用藥物浸泡消毒解決這些問題，存在抗菌廣譜、容易產生細菌耐藥性及其他副作用等固有的局限性。銀系無機抗菌劑具有很好的生物安全性，是目前口腔科臨床材料改性中比較理想的抗菌材料，克服了傳統有機抗菌劑抗菌譜廣、易產生耐藥性等缺點。作者采用等離子噴涂方式制備了鈷鉻合金含銀抗菌涂層試件, 其具有良好的抗菌性能，但涂銀是否對鈷鉻合金的生物相容性產生影響并不清楚。該研究中，作者制備了鈷鉻合金含銀抗菌涂層試件浸提液，檢測其對小鼠成纖維細胞L929細胞增殖和凋亡的影響，初步評價鈷鉻合金含銀抗菌涂層的生物學性能。

1 材料與方法

1.1試件制作與分組精密鑄造的規格為15 mm×15 mm×2 mm的正方形鈷鉻合金試件(德國BEGO公司)20個，利用萬能工具磨床將所有試件切割成10 mm×10 mm×1 mm。其中10個試件表面應用等離子噴涂的方法制作含銀抗菌涂層，所用噴涂材料為銀粉和鉻粉，由北京礦業研究院提供，質量分數分別為3%和97%；剩余10個試件不做任何處理，作為對照。試件表面拋光后，經無水乙醇超聲洗滌15 min，去離子水洗3次，烘干，121 ℃高壓滅菌后待用。

1.2浸提液的制備無菌條件下將2組試件置于24孔板中，以含體積分數10%小牛血清的RPMI 1640培養液為浸提介質，參考GB/T 16886.12-2005(醫療器械生物學評價第12部分：樣品制備與參照樣品)，按試件表面積與浸提液體積比為1.25 cm2/mL，于37 ℃、體積分數5%CO2、95%濕度的培養箱(日本Sanyo)中浸提24 h，浸提液經0.22 μm濾膜過濾除菌后待用。

1.3浸提液對L929細胞毒性的測定用2.5 g/L胰蛋白酶(美國Gibco公司)消化對數生長期的L929細胞(天津塞爾生物技術有限公司)，配置細胞懸液，將懸液加入96孔板，并排接種6組，每組5孔，置于孵箱中孵育24 h后,棄去舊培養液，分別加入新鮮培養液(陰性對照組)，體積分數100%、75%、50%、25%含銀抗菌涂層試件浸提液(含銀浸提液)和對照試件浸提液(對照浸提液)，每孔200 μL，置于37 ℃、體積分數5%CO2、95%濕度的培養箱中分別孵育24、48和72 h。然后MTT法檢測細胞增殖情況，用酶標儀(美國BIO-RAD)在490 nm波長下測定各孔吸光度值，以生理鹽水孔作空白對照，計算細胞相對增殖率，參考GB/T 16886.5-2003(醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗)，按相對增殖率評定材料毒性級別[1]。

1.4浸提液對L929細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響取對數生長期的L929細胞，胰蛋白酶消化后，用RPMI 1640培養液配成密度約為6.0×104mL-1的細胞懸液。將1 mL細胞懸液加入已有蓋玻片的6孔板中，每組6個復孔，放入37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養24 h，使細胞貼壁生長。倒掉原培養液，實驗分3組處理，分別加入含銀浸提液原液、對照浸提液原液和RPMI 1640培養液(陰性對照)1 mL，在37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養48 h后，棄上清液，多聚甲醛室溫固定40 min，取出細胞爬片，中性樹膠粘于載玻片上， 37 ℃山羊血清封閉20 min。每張玻片滴加按100倍稀釋的一抗(鼠抗兔Bcl-2或Bax單克隆抗體)，陰性對照用PBS代替一抗，按說明書操作，進行免疫細胞化學染色。采用Image pro plus 6.0醫學圖像分析系統對蛋白表達強度進行半定量分析。每張玻片選取5個高倍視野，測定每個視野下陽性區光密度值(IOD)，取平均值，表示蛋白表達水平。

1.5統計學處理應用SPSS 17.0進行統計分析。采用單因素方差分析對各組吸光度值、Bcl-2和Bax表達水平及Bcl-2/Bax進行比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1細胞毒性測定結果各組吸光度值見表1。不同濃度的浸提液對L929細胞的毒性均為0～1級。

表1 各組吸光度值的比較

2.2各組細胞Bcl-2和Bax蛋白表達水平的比較

見表2。含銀浸提液組細胞Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax蛋白表達水平與對照浸提液組比較，差異均無統計學意義，但2組各指標均高于陰性對照組。

表2 各組細胞Bcl-2、Bax蛋白表達水平及Bcl-2/Bax的比較

*:與陰性對照組比較，P<0.05。

3 討論

細胞毒性試驗是通過細胞培養技術測定生物材料或其浸提液對細胞的毒性作用,包括溶解(細胞死亡)、抑制細胞生長和其他毒性等。它在評價材料生物相容性方面的地位已得到證實[2]。細胞毒性試驗作為一種初級快速的毒性篩選和生物安全性評價方法，在口腔科領域具有十分重要的地位[3]。

張敏等[4]對涂銀羥基磷灰石種植體的細胞毒性進行了評價，發現其具有良好的生物活性。朱輝等[5]證實載銀羥基磷灰石人工骨具有良好的生物相容性及安全性。Ando等[6]實驗發現含銀磷酸鈣涂層具有高抗菌活性、低毒性，并且能抑制細菌黏附的優良特性。該實驗結果顯示，不同濃度含銀抗菌涂層的鈷鉻合金試件浸提液對L929細胞的毒級均為0～1級，有極輕微細胞毒性，與鈷鉻合金試件浸提液及陰性對照的毒性相當。

生物材料誘導細胞凋亡的信號途徑主要包括膜死亡受體信號途徑、線粒體途徑和其他參與凋亡信號調控的傳導系統[7]。其中，Bcl-2和Bax在線粒體途徑中起著非常重要的調控作用。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促進凋亡因子[8-9]。Bcl-2蛋白能夠阻遏細胞凋亡，延長細胞的壽命，參與調控細胞增殖與凋亡的動態平衡，同細胞分化、成熟、組織器官的發育及腫瘤的發生關系密切。研究[10]發現，烤瓷合金在齦溝液內腐蝕析出的金屬離子及其衍生物可引起機體組織的毒性反應，并可引起細胞凋亡。Bax與Bcl-2形成異二聚體復合物，可促進細胞凋亡，其比值對細胞是否發生凋亡起決定性作用。 Bcl-2/Bax比值越高，細胞的生存率越高；比值越低，細胞的生存率越低[11]。該實驗結果表明，用含銀抗菌涂層鈷鉻合金試件浸提液處理后，L929細胞Bcl-2/Bax比值與對照試件浸提液接近，提示鈷鉻合金含銀抗菌涂層對細胞凋亡的作用與鈷鉻合金接近。

總之，作者應用MTT法在細胞水平上評價了鈷鉻合金含銀抗菌涂層的細胞毒性，應用免疫細胞化學染色法從分子水平上觀察了鈷鉻合金含銀抗菌涂層對細胞Bcl-2和Bax表達的影響，從分子水平上證實了該涂層的生物毒性較小，生物相容性較好。但對這種涂層材料生物相容性的全面評價仍需結合其他實驗進行更深入的研究與探討。

[1]趙敏，梁銳英，孟賀，等.鑄造鈷鉻合金含銀抗菌涂層表面性能及體外細胞毒性研究[J].中華口腔醫學雜志,2012，47(10):626

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[4]張敏，史建陸，林昌建.含銀羥基磷灰石種植體的細胞毒性研究[J].臨床口腔醫學雜志，2009,25(3)：139

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