粉防己堿對EC9706細胞增殖、細胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表達的影響

段 昱，呂 品，賀付成，趙 雪

鄭州大學第一附屬醫院檢驗科 鄭州 450052

磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是一類參與脂類代謝和調節的酶類。哺乳動物體內的sPLA2包括十余種亞型，分泌型PLA2-Ⅱa(secretory PLA2-Ⅱa, sPLA2-Ⅱa)是PLA2超家族成員之一[1]。前期研究[2]已表明sPLA2-Ⅱa蛋白及mRNA在食管鱗癌組織中表達升高，可能參與了食管癌的發生。粉防己堿(tetrandrine，Tet)是從中草藥粉防己的根塊中提取的一種生物堿，又名漢防己甲素。研究[3-4]發現Tet可抑制包括PLA2在內的多種酶類的活性，并且具有一定的抗癌作用。作者采用四甲基偶氮唑藍(MTT)、流式細胞術及免疫細胞化學SP法檢測Tet對食管鱗狀細胞癌EC9706細胞增殖、細胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表達的影響，探討Tet抑制食管癌細胞增殖的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1材料EC9706細胞系由中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈。Tet、二甲基亞砜(DMSO)及MTT均購自Sigma公司。RPMI 1640細胞培養液購自美國Gibco公司。胎牛血清為杭州四季青公司產品。兔抗人sPLA2-Ⅱa多克隆抗體購自香港ABCAM公司。免疫細胞化學SP試劑盒購自美國ZYMED公司。Tet用DMSO助溶，然后配成100 μmol/L儲存液，存于4 ℃冰箱，使用時用RPMI 1640培養液稀釋至15 μmol/L。

1.2細胞培養EC9706細胞單層貼壁培養于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，在37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養，2～3 d換液一次，胰蛋白酶常規消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3細胞增殖抑制率的MTT法檢測取對數生長期細胞，調整細胞密度為6×104mL-1，按每孔0.2 mL接種于96孔培養板中，共接種60孔。培養24 h后，分4組處理。實驗組分別用Tet作用細胞1、3和5 d，對照組不作任何處理，每組設15個復孔。加入MTT 20 μL，繼續孵育4 h后，每孔加100 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解，于酶標儀上測定波長492 nm處各孔的吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

1.4細胞周期檢測細胞同1.3中分組處理，每組設7個復孔，收集細胞，胰蛋白酶消化，離心、棄上清，用PBS洗2遍，加入體積分數70%乙醇，4 ℃保存。細胞染色前用PBS洗2遍，細胞沉淀重懸于500 μL PBS中(包含PI 50 mg/L，RNaseA 100 mg/L)，避光染色30 min，細胞經300目尼龍網過濾，流式細胞儀測定細胞周期分布。

1.5sPLA2-Ⅱa蛋白表達的免疫細胞化學檢測取對數生長期的EC9706細胞于24孔培養板中，用15 μmol/L的Tet于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養，1、3和5 d后取出細胞爬片(Tet作用1、3和5 d組)，以不作處理的EC9706細胞為對照組，pH 7.4 PBS沖洗，體積分數80%的丙酮固定30 min后，4 ℃冰箱保存，用于免疫細胞化學檢測。一抗兔抗人sPLA2-Ⅱa多克隆抗體按1150稀釋，PBS代替一抗作為陰性對照。所有爬片經高壓抗原修復，其余步驟按免疫細胞化學SP試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木素復染，以高清圖像處理系統測定著色細胞的灰度值，評定sPLA2-Ⅱa蛋白表達的強弱。每組均設5個平行對照。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0進行分析，應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較各組細胞增殖抑制率、細胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1Tet對EC9706細胞增殖和細胞周期的影響見表1。MTT檢測結果顯示，經Tet作用1、3和5 d后細胞增殖抑制率依次增高。細胞周期檢測顯示，Tet作用組G0/G1期細胞比例高于對照組，而S、G2/M期細胞比例低于對照組(P<0.05)。

表1 Tet對EC9706細胞增殖、細胞周期和sPLA2-Ⅱa蛋白表達的影響

除G2/M期Tet作用3 d組與5 d組差異無統計學意義外，其余各組兩兩比較P均<0.05。

2.2Tet對EC9706細胞sPLA2-Ⅱa蛋白表達的影響見圖1、表1。sPLA2-Ⅱa蛋白免疫細胞化學染色陽性著色呈棕黃色，位于胞質。與對照組比較，Tet作用不同時間后細胞著色無明顯改變，各組sPLA2-Ⅱa蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 各組細胞中sPLA2-Ⅱa蛋白的表達(SP,×200)

3 討論

Tet是千金藤屬防己科植物粉防己的主要活性成分，其化學結構屬雙芐基異喹啉類。作為一種鈣離子拮抗劑，其消炎鎮痛作用已為人們所熟知。近年來，眾多研究[5-8]表明其在抑制腫瘤細胞增殖和放、化療增敏上也發揮重要作用。

PLA2在自然界中分布較廣泛，可催化水解甘油磷脂的酰基酯鍵。根據PLA2在組織內的分布、氨基酸序列同源性及生化功能等特征可將其分為分泌型、胞質型和非鈣離子依賴型[9]。sPLA2-Ⅱa是PLA2家族成員之一，研究[4，10-12]表明其在食管癌、肺癌、乳癌、前列腺癌等癌組織中均呈高表達，sPLA2-Ⅱa基因還可促進大腸癌細胞系的增殖，并參與腫瘤的發生和免疫。Dong等[13]研究發現sPLA2-Ⅱa的作用可能與HER/HER2-PI3K-Akt-NF-κB信號通路的激活有關，高表達的sPLA2-Ⅱa促進了癌細胞的生長。

作者采用MTT法、流式細胞術和免疫細胞化學SP法檢測了Tet作用于EC9706細胞后，細胞增殖、細胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表達的變化，結果表明Tet能夠顯著抑制EC9706細胞的增殖。Tet作用于食管癌細胞后，細胞周期發生了G1→S期阻滯，但sPLA2-Ⅱa蛋白的表達差異無統計學意義。

Tet與一般的細胞毒性化療藥物相比，毒副作用小，對肝腎功能無損害且無骨髓抑制，是一種有效且較安全的抗癌藥物。雖然Tet對EC9706細胞中sPLA2-Ⅱa蛋白的表達無影響，但作為酶抑制劑，Tet是否通過對sPLA2-Ⅱa酶活性的抑制來阻礙食管癌細胞的增殖以及Tet是否還存在其他抗癌機制值得深入研究。

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