HCV核心蛋白對人肝癌細胞系SMMC-7721增殖的影響*

李志勤，孫長宇，余祖江，黃建敏，李建生，張 毅#

1)鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州450052 2)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院消化內科 鄭州 450052

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)為有包膜的單股正鏈RNA病毒，其編碼區只有一個開放閱讀框，編碼長3 010～3 030個氨基酸序列的蛋白前體，其中HCV核心蛋白是一種多功能蛋白，由191個氨基酸殘基組成, 在慢性丙型肝炎、丙型肝炎肝硬化及肝細胞癌的致病過程中起到重要作用[1]。HCV核心蛋白通過影響線粒體功能，致使與過氧化反應有關的細胞生長相關基因表達異常；此外，HCV核心蛋白還通過調節細胞基因表達,影響細胞間的信號傳導(如MAPK途徑),從而導致轉錄因子活化和細胞周期的異常[2]，但HCV的致癌機制尚不清楚。該研究將HCV核心蛋白質粒轉染低侵襲性肝癌細胞系SMMC-7721，觀察其對該細胞系增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料pcDNA3.0-C-EGFP重組質粒和pcDNA3.0(-)質粒、細胞系SMMC-7721由鄭州大學第一附屬醫院感染科孫長宇教授惠贈。TRIREAGENA(美國Molecular Research Centre公司)，200 U/mL Revert AIdTMHMinus M-MULV逆轉錄酶、5 U/mL Taq DNA聚合酶(華美生物公司)，驢抗羊抗體HCV核心蛋白抗體(美國Santa Cruz公司)，驢抗羊抗體、羊抗小鼠二抗(上海康成生物公司)，強化化學發光試劑盒(美國Pierce公司)，HCV核心蛋白 ELISA檢測試劑盒(科華生物公司)，MTT細胞增殖檢測試劑盒(上海吉泰生物公司)，細胞侵襲小室Transwell(孔徑8.0 μm)、濾膜(孔徑8.0 μm)均購自美國Costar公司，Matrigel(美國BD公司)，Rohe PCR儀、Bio-Rad電泳儀、電轉儀、96孔酶標儀。

1.2細胞轉染將SMMC-7721細胞在含體積分數7%胎牛血清的RPMI 1640培養基中連續培養。轉染前一天將細胞接種于6孔培養板，每孔2×105個細胞，過夜培養后，細胞分2組，分別進行pcDNA3.0-C-EGFP 重組質粒(觀察組) 和 pcDNA3.0(-)質粒(空質粒組)轉染，操作按照Lipofectamine2000轉染手冊進行。

1.3轉染細胞HCV核心蛋白的檢測

1.3.1 RT-PCR法檢測轉染細胞HCV核心蛋白的mRNA 細胞轉染24 h后，用Trizol試劑提取RNA，逆轉錄得cDNA，以cDNA為模板，以β-actin為內參，進行PCR擴增。HCV核心蛋白引物序列如下：上游引物 5’-CGCGGATCCATGAGCACAAATCC-3’(1～14 bp)，下游引物5’-CCGGAATTCGCAAC CGGGC-3’(505～516 bp)。PCR反應體系(50 μL):雙蒸水34.5 μL,10×緩沖液5 μL,dNTPs(25 mmol/L)4 μL,Mg2+3 μL,模板DNA(45 ng)1 μL ,上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL,高保真Taq酶0.5 μL。反應條件: 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 10個循環；94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 20個循環；72 ℃ 7 min。PCR產物于10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠成像系統照相分析。目的基因mRNA相對表達量=(目的基因條帶面積×顏色強度)/(β-actin條帶面積×顏色強度)。

1.3.2 Western blot法檢測轉染細胞HCV核心蛋白 收集轉染2～3 d后的細胞，加入裂解液后破碎，采用考馬斯亮藍G250方法測定蛋白質濃度，取40 mg樣品，加等體積的上樣緩沖液后進行電泳分離，轉膜，脫脂牛奶封膜2 h,加入HCV核心蛋白單克隆抗體(按1 000倍稀釋)溫育2 h,磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次，加入辣根過氧化酶標記的羊抗小鼠二抗溫育1 h，PBST洗膜4次,用電化學發光顯色系統進行顯色。用Quantity one軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.3.3 轉染細胞培養上清中HCV核心蛋白的檢測

取轉染2～3 d后的細胞培養上清液100 μL，加入96孔板4 ℃包被過夜，硝酸鹽緩沖液洗板5次，37 ℃封閉1 h,PBST洗板5次，加入HCV核心蛋白抗體10 μL/孔，37 ℃ 1 h,甩盡板內液體,用洗滌液洗滌反應板并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干),反復洗滌5次。將辣根過氧化酶偶聯的驢抗羊抗體稀釋后，加入反應孔內，PBS洗板5次。每孔加入50 μL底物A和底物B,輕輕混勻30 s,室溫避光10 min。每孔加入100 μL終止液，輕輕振蕩30 s,30 min內在450 nm處讀吸光度(A)值，利用標準曲線計算蛋白表達量。

1.4轉染細胞纖維連接蛋白黏附實驗每孔100 μL纖維連接蛋白(10 mg/L)包被96孔板，以100 mg/L多聚賴氨酸和體積分數1%牛血清白蛋白(BSA)包被孔作為最大和最小黏附參照。每孔加入5×104個轉染2～3 d后的細胞，37 ℃、體積分數5%CO2孵育2 h。用PBS洗滌除去未黏附細胞，多聚甲醛固定，結晶紫溶液染色25 min，每孔加入400 μL 體積分數0.5%TritonX-100過液，酶標儀測定590 nm處的A值。細胞黏附率=(A樣品-ABSA包被)/(A多聚賴氨酸包被-ABSA包被)×100%。

1.5轉染細胞增殖率的檢測將轉染2～3 d 后的細胞分別按(1.5～2.0)×104/孔的密度接種于96孔板,每孔100 μL，設立陰性對照組。采用MTT法觀察細胞增殖情況，酶標儀檢測波長為570 nm。每組8個復孔，重復3次。細胞增殖率=(實驗組A-對照組A)/對照組A×100%。

1.6轉染細胞侵襲和運動實驗在Transwell上室加入100 μL Matrigel，37 ℃孵育2 h，加入無血清RPMI 1640稀釋的1×105個轉染2～3 d后的細胞懸液，下室加入500 μL 條件培養基；培養箱內孵育48 h，取出上室用棉棒擦去Matrigel和未侵襲細胞，多聚甲醛固定10 min，Giemsa染色15 min，取下濾膜，于200倍光鏡下計數移至微孔膜下層的細胞(穿膜細胞數)。每個樣本計數8個視野，取平均值。運動試驗中除不加Matrigel外，余同侵襲實驗。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析。觀察組和空質粒組HCV核心蛋白表達水平、細胞黏附率、侵襲和運動實驗穿膜細胞數的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組細胞HCV核心蛋白表達水平的比較2組細胞HCV核心蛋白mRNA、蛋白及培養上清HCV核心蛋白測定結果見表1?？梢钥闯?，觀察組HCV核心蛋白表達水平高于空質粒組。

表1 2組HCV核心蛋白表達水平的比較

2.2細胞增殖率的比較陰性對照組、空質粒組和觀察組細胞增殖率分別為(20.4±2.1)%、(16.9±4.6)%和(46.5±3.3)%，3組比較，差異有統計學意義(F=68.231，P=0.001)，觀察組細胞增殖率明顯高于空質粒組(P=0.002)。

2.3細胞黏附、侵襲和運動實驗結果觀察組細胞黏附率高于空質粒組，侵襲和運動實驗穿膜細胞數大于空質粒組，見表2。

表2 2組細胞黏附、侵襲和運動實驗結果

3 討論

HCV核心蛋白除了與病毒核衣殼的組成有關以外，還參與病毒顆粒的裝配和釋放，并與宿主糖蛋白相互作用，完成病毒顆粒的成熟與分泌。HCV核心蛋白通過與細胞內重要調節蛋白結合，影響某些重要信號通路的傳遞，進而直接參與宿主細胞的脂質代謝、免疫調節、細胞信號轉導、細胞凋亡以及細胞轉化過程,與HCV感染后肝病的發生發展密切相關。

大量研究[3-6]表明HCV核心蛋白能夠與介導細胞凋亡的諸多相關信號分子相互作用,誘導或抑制細胞的凋亡,具體包括Fas抗原、Bcl-2B家族、淋巴毒素β受體等信號分子。抑制肝細胞凋亡一直被認為是HCV核心蛋白導致肝細胞癌發生的重要機制之一。也有研究[7]證明HCV核心蛋白能激活或上調NF-κB的活性,NF-κB與細胞凋亡關系密切,參與多種凋亡相關基因的轉錄調控,具有抑制細胞凋亡而導致細胞癌變的作用。羅瓊等[8]報道表達HCV核心蛋白的HepG2細胞系Cyclin D1和pRb/p130的表達下調，細胞生長周期被抑制。另有報道[9]HCV核心蛋白通過增強Wnt/β信號傳導途徑導致肝癌細胞增長。該研究中，SMMC-7721細胞系是低侵襲性不轉移的人肝癌細胞系，在轉染pcDNA3.0-C-EGFP 重組質粒后高表達HCV核心蛋白；體外功能實驗結果提示，轉染pcDNA3.0-C-EGFP 重組質粒后，SMMC-7721細胞黏附、運動和侵襲能力明顯增強，同時細胞增殖能力也明顯增強。由此推測HCV核心蛋白可以促進SMMC-7721細胞系的增殖，HCV核心蛋白與HCV感染所致肝細胞癌的發生有直接關系，但HCV核心蛋白致人肝細胞發生惡性轉化的具體分子機制還有待于進一步的研究和闡明。

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