接頭相關蛋白復合物3δ亞單位與BRD7的相互作用及其功能*

徐曉杰，周 鳴，李桂源#

1)南陽醫(yī)學高等專科學校團委 南陽 473000 2)中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所分子遺傳室 長沙 410078

1997年作者所在的研究室運用cDNA代表性差異分析方法克隆了一個在鼻咽癌活檢組織中表達下調的新基因BRD7(GenBank登錄號為AF152604，主要分布于胞核)[1]。轉基因實驗[2]顯示，BRD7基因具有抑制鼻咽癌細胞株HNE1生長的作用，并可降低其成瘤性和體內致瘤性。以余鷹博士為首的課題組[3]采用酵母雙雜交技術從人胎腦的cDNA文庫中篩選到一個與BRD7基因存在交互作用的接頭相關蛋白復合物3(adaptor-related protein complex 3,AP3)δ亞單位基因。作者首先構建了2個AP3δ基因的真核表達載體，然后通過細胞免疫共定位和免疫共沉淀法觀察AP3δ蛋白與BRD7蛋白的交互作用；并采用半定量逆轉錄PCR、熒光素酶實驗初步研究了AP3δ蛋白與BRD7蛋白在功能學上的關系。

1 材料與方法

1.1主要材料和試劑質粒和細胞系： 真核表達質粒(pCMV-HA、pEGFP-C2)由中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所分子遺傳室購買并保存，pACT2-AP3δ融合質粒由余鷹博士提供，真核表達載體pCMV-Myc-BRD7由中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所分子遺傳室構建保存，E2F3啟動子熒光報告質粒由周潔博士構建，CyclinD1啟動子熒光報告質粒購自Upstate公司。非洲綠猴腎COS7細胞購自中國醫(yī)學科學院細胞庫，HNE1細胞株由中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所建立保存，穩(wěn)定轉染pcDNA3.1-BRD7與空白載體pcDNA3.1(-)的HNE1細胞株由余鷹博士建立。主要試劑和抗體：RPMI 1640培養(yǎng)基、RNA抽提試劑Trizol購自GBICOL/BRL公司，脂質體購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、熒光素酶試劑盒購自Promega公司，小量膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，限制性內切酶購自華美生物工程公司，所用抗體購自Santa Cruz公司和Pierce公司，化學發(fā)光檢測試劑盒和免疫共沉淀試劑盒購自Pierce公司。核苷酸引物的設計與合成：利用Goldkey軟件分析設計好的引物，確認引物內無發(fā)夾結構，引物間無二聚體形成。相關引物(表1)由上海博亞生物公司設計合成。

表1 引物序列

1.2AP3δ基因真核表達載體的構建pACT2-AP3δ融合質粒經BgIⅡ單酶切，回收獲得目的片段AP3δ基因。pCMV-HA載體和pEGFP-C2載體經BgIⅡ單酶切，并經去磷酸化處理后，分別與目的片段連接，重組體再經BgIⅡ單酶切鑒定插入成功與否。然后根據(jù)2個重組體的酶切圖譜，pCMV-HA-AP3δ選擇EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定插入片段的方向；pEGFP-C2-AP3δ選擇SalⅠ單酶切鑒定插入片段的方向。最后送樣品測序。

1.3AP3δ蛋白的亞細胞定位檢測6孔板中每孔接種約2×105個COS7細胞，細胞生長至50%～70%融合后，將2 μg pEGFP-C2-AP3δ加入100 μL無血清培養(yǎng)基中，再加入5 μL脂質體，常規(guī)轉染30 h后，取出玻片固定，DAPI染色，觀察結果。

1.4AP3δ與BRD7在COS7細胞中的共定位檢測將pEGFP-C2-AP3δ與pCMV-Myc-BRD7經1.3步驟共同轉染COS7細胞。轉染30 h后取出玻片，清洗、風干、固定后加入封閉血清4 ℃封閉1 h，吸干血清，將一抗anti-Myc均勻覆蓋于玻片表面，4 ℃孵育過夜，然后1×PBS清洗玻片4×15 min，將二抗cy3標記的抗鼠 IgG均勻覆蓋于玻片表面，37 ℃孵育1 h，1×PBS清洗玻片4×15 min，DAPI染色，觀察結果。

1.5AP3δ蛋白與BRD7蛋白相互作用的觀察將pCMV-HA-AP3δ和pCMV-Myc-BRD7經1.3步驟共同轉染COS7細胞。更換正常培養(yǎng)基24 h后，用預冷的1×PBS洗細胞2～3次，加入適量裂解緩沖液，冰上放置20 min； 用細胞刮子將細胞刮入裂解液，并移入預冷的Tube管中；12 000 r/min 4 ℃離心10 min，吸取上清至另一Tube管中，保存于-70 ℃。 抽提的蛋白樣品95～100 ℃煮5 min后行SDS-PAGE 電泳，轉膜，麗春紅染色、封閉。孵育抗Myc抗體：1×PBS 中加入50 g/L蛋白干粉為抗體稀釋液， 滴度為0.5～1.0 mg/L，4 ℃搖床孵育過夜，用1×PBS洗膜4～5次，5 min/次；孵育抗HA抗體：在1×PBS 中加入50 g/L蛋白干粉為抗體稀釋液，二抗滴度為12 000，室溫2 h；用1×PBS洗膜4～5次，5 min/次。將等量的化學發(fā)光液A和B混合，加于膜上后壓片顯影。

1.6BRD7與AP3δ對COS7細胞中E2F3和CyclinD1活性的影響采用熒光素酶實驗。取24孔板，每孔接種0.5×105個COS7細胞，24 h后細胞生長至50%～70%融合狀態(tài)，按1.3轉染方法分2部分轉染。A部分分為4組，分別轉染E2F3啟動子熒光報告質粒，E2F3啟動子熒光報告質粒和pCMV-Myc-BRD7，E2F3啟動子熒光報告質粒和pCMV-HA-AP3δ，E2F3啟動子熒光報告質粒、 pCMV-Myc-BRD7和pCMV-HA-AP3δ。B部分同上分組，其中E2F3啟動子熒光報告質粒換為CyclinD1啟動子熒光報告質粒，余同。在2個實驗中均加入β-Gal為內對照，用來平衡轉染效率。倒掉細胞培養(yǎng)基，用1×PBS洗細胞2～3次；加入60 μL裂解緩沖液，室溫放置15～20 min后移入Tube管中，離心5～10 s；取20 μL細胞裂解物加入100 μL底物混勻，放入單光子檢測儀中進行測定。棄去細胞培養(yǎng)基，用預冷的1×PBS洗滌細胞2～3次；加入50 μL裂解緩沖液，4 ℃搖床搖動15 min，使細胞充分裂解；將細胞裂解液移入96孔板中，加入50 μL檢測緩沖液，混合，37 ℃孵育30 min；加入150 μL終止緩沖液終止反應；用酶聯(lián)免疫標記儀檢測酶活性。實驗重復3次。

1.7HNE1細胞中BRD7的重表達對AP3δmRNA表達水平的影響復蘇穩(wěn)定轉染pcDNA3.1-BRD7或pcDNA3.1(-)的HNE1，培養(yǎng)2～3 d后收集細胞，抽提RNA，逆轉錄得cDNA，以此為模板進行PCR。PCR反應體系： MgCl23 μL，dNTP 4 μL，Buffer 5 μL，模板cDNA 5 μL，高保真酶 1 μL，AP3δ基因引物 0.1 mmol/L，ddH2O補至50 μL。當AP3δ基因擴增5個循環(huán)時，再加入內對照GAPDH引物0.1 mmol/L進行25個循環(huán)。PCR反應參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，57 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，DNA膠回收試劑盒純化，操作方法按產品說明書進行。

2 結果

2.1重組體pCMV-HA-AP3δ和pEGFP-C2-AP3δ的鑒定AP3δ與pCMV-HA連接的重組體單酶切后產生3 800 bp和1 700 bp的2個片段(圖1)，正向插入的重組體雙酶切后產生4 500 bp、854 bp和140 bp的3個片段(圖2)。結果示2個克隆為陽性克隆，挑選其中1個克隆送測序鑒定，結果顯示，重組體無序列錯配和閱讀框架改變，表明pCMV-HA-AP3δ 構建成功。AP3δ與pEGFP-C2連接的重組體單酶切后產生4 700 bp和1 700 bp的2個片段(圖3)，正向插入的重組體被SalⅠ單酶切后產生4 700 bp和1 700 bp的2個片段(圖4)，結果顯示1個克隆為陽性克隆，測序結果顯示，重組體無序列錯配和閱讀框架改變，表明pEGFP-C2-AP3δ 構建成功。

圖1 pCMV-HA-AP3δ重組體的單酶切鑒定

圖2 pCMV-HA-AP3δ重組體的雙酶切鑒定

圖3 pEGFP-C2-AP3δ重組體的BgI Ⅱ酶切鑒定

圖4 pEGFP-C2-AP3δ重組體的SalⅠ酶切鑒定

2.2AP3δ在COS7細胞中的亞細胞定位AP3δ蛋白在COS7細胞的胞質、胞核中均有分布，但主要呈團塊狀分布于胞核(圖5)。

圖5 AP3δ蛋白在COS7細胞中的定位

2.3AP3δ與BRD7在COS7細胞中的共定位

AP3δ與BRD7在COS7細胞中共定位于胞核(圖6)。

圖6 AP3δ與BRD7在COS7細胞中的定位

2.4AP3δ蛋白與BRD7蛋白的相互作用同時轉染pCMV-Myc-BRD7和pCMV-HA-AP3δ的COS7細胞中檢測到AP3δ蛋白的表達，AP3δ和空白載體共同轉染的COS7細胞中未檢測到AP3δ蛋白的表達(圖7)，說明AP3δ蛋白與BRD7蛋白存在相互作用。

2.5BRD7和AP3δ對COS7細胞中E2F3和CyclinD1活性的影響見表2、3。

圖7 AP3δ蛋白與BRD7蛋白的相互作用

表2 E2F3啟動子熒光報告質粒熒光素酶活性相對值測定結果(n=3)

表3 CyclinD1啟動子熒光報告質粒熒光素酶活性相對值測定結果(n=3)

2.6HNE1細胞中BRD7的重表達對AP3δmRNA表達水平的影響與轉染空白載體的HNE1細胞相比，pcDNA3.1-BRD7穩(wěn)定轉染的HNE1細胞中AP3δ mRNA的表達水平明顯上調(圖8)。

圖8 HNE1細胞中BRD7的重表達對AP3δ mRNA表達水平的影響

3 討論

鼻咽癌是我國南方地區(qū)高發(fā)的多基因遺傳性腫瘤，其發(fā)病機制和遺傳背景相當復雜。作者所在的研究室前期工作[4]顯示BRD7很可能是鼻咽癌的一個遺傳易感基因，并通過酵母雙雜交系統(tǒng)從人胎腦的cDNA文庫中篩選出6種與BRD7蛋白存在交互作用的蛋白，其中AP3是由δ、β3、μ3、σ3四個亞單位構成的異源四聚體，δ和β3為較大的蛋白鏈，且δ蛋白連接有各種附屬因子,可能是AP3中起主要功能的亞單位。利用生物信息學軟件對AP3δ的亞細胞定位情況進行預測，發(fā)現(xiàn)它具有一個核定位信號區(qū)域，分布在胞核的概率高達70%[5]。為了檢測單獨存在的AP3δ蛋白在細胞中的定位情況，該研究通過GFP介導的細胞熒光實驗觀察它的亞細胞定位，結果顯示，AP3δ蛋白在COS7細胞的胞質、胞核中均有分布，但主要呈團塊狀分布于胞核，與軟件的預測基本一致。明確COS7細胞中AP3δ主要定位于胞核后，作者進一步采用熒光定位法觀察到AP3δ蛋白在COS7細胞胞核中與BRD7共同存在的現(xiàn)象；之后又采用免疫共沉淀的方法證實了BRD7與AP3δ蛋白存在相互作用。

作者所在的研究室的前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，BRD7對鼻咽癌細胞的生長具有抑制作用。 而BRD7主要是通過下調Ras/MEK/ERK和Rb/E2F兩條信號轉導通路的活性抑制細胞周期G1-S的進程來發(fā)揮這一抑制作用[6]。E2F3和CyclinD1是Rb/E2F通路的兩個重要分子。該研究發(fā)現(xiàn)，與BRD7單獨作用相比，在AP3δ基因參與后，BRD7對E2F3和CyclinD1啟動子活性的下調作用增強了50%左右，提示在BRD7下調Rb/E2F信號轉導通路活性的過程中，AP3δ能夠協(xié)同BRD7發(fā)揮功能。另外，在BRD7穩(wěn)定轉染的HNE1細胞中，AP3δ mRNA的表達較空白載體轉染組有明顯上調，提示BRD7能夠促進HNE1細胞中AP3δ mRNA的表達。諸多文獻[7-8]顯示，如果兩種蛋白存在交互作用，那么它們在功能上也密切關聯(lián)，共同參與某一信號轉導通路或疾病發(fā)病過程。因此，該研究結果支持BRD7蛋白和AP3δ蛋白在功能上密切關聯(lián)、相互調節(jié)，可能共同參與了鼻咽癌的發(fā)病過程。但它們之間具體的作用機制如何以及它們相互作用的具體區(qū)域何在，仍有待進一步的研究。

[1] Wu MH, Li XY,Li GY, et al. Signaling transduction network mediated by tumor suppressor/susceptibility genes in NPC[J]. Curr Genomics, 2009, 10(4):216

[2] Li XL, Wu MH, Li GY, et al. Functional genomics of nasopharyngeal carcinoma susceptibility/suppressor gene[J]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 2008,33(7):553

[3] Zhou M, Liu H, Xu X, et al. Identification of nuclear localization signal that governs nuclear import of BRD7 and its essential roles in inhibiting cell cycle progression[J]. J Cell Biochem, 2006,98(4):920

[4] 李淑芳,周鳴,劉華英,等.BRD7調控Rb/E2F通路的分子機制研究[J].生物化學與生物物理進展，2007,34(8):881

[5] Bendor J, Lizardi-Ortiz JE, Westphalen RI, et al.AGAP1/AP-3-dependent endocytic recycling of M5 muscarinic receptors promotes dopamine release [J]. EMBO J,2010,29

(16):2813

[6] Hashimoto R, Ohi K, Okada T, et al. Association analysis between schizophrenia and the AP-3 complex genes[J]. Neurosci Res, 2009,65(1):113

[7] Yavuz S, Santarella-Mellwig R, Koch B, et al. NLS-mediated NPC functions of the nucleoporin Pom121[J].FEBS Lett,2010,584(15):3292

[8] 徐曉杰，周鳴，李桂源.bromodomain結構域對BRD7亞細胞定位的影響[J].鄭州大學學報:醫(yī)學版,2011,46(4):542