舒尼替尼聯合多西他賽對A549細胞增殖、凋亡、細胞周期及c-met、mek、erk mRNA表達的影響

蔡 晶，韓 娜，張 芳，方 黎，鄭鵬遠，張中冕

鄭州大學第二附屬醫院腫瘤科 鄭州 450014

肺癌是目前全球最常見、對人類生命與健康危害最大的惡性腫瘤，發病率和死亡率均居惡性腫瘤首位，且發病率仍呈逐年上升的趨勢。其中非小細胞肺癌約占肺癌總數的80%；70%～80%的非小細胞肺癌患者在確診時已經是肺癌晚期，早期患者術后仍有30%～70%會發生局部復發或遠處轉移[1-2]。藥物治療目前仍是晚期肺癌治療的重要手段之一，但是治療結果仍不令人滿意。因此，探索新的治療方案是必要的。有臨床研究[3-4]顯示分子靶向藥物聯合化療可進一步提高療效。舒尼替尼是一種口服的小分子酪氨酸激酶抑制劑，具有強力的抗血管生成作用和抗腫瘤作用[3]。多西他賽是一種半合成的紫杉烷類抗癌藥物，與β微管蛋白結合，可誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡[4]。在美國，多西他賽既可以單獨應用，也可以與其他藥物聯合治療實體瘤如肺癌、乳癌等[5]。該研究旨在探討多西他賽和舒尼替尼單用或聯用對人類非小細胞肺癌細胞株A549的影響。

1 材料與方法

1.1材料A549細胞株由鄭州大學醫學院提供。舒尼替尼購自Pfizer公司，多西他賽購自英國Aventis Pharma Dagenham公司，RPMI 1640培養液、2.5 g/L胰蛋白酶(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、Annexin V-FITC和PI凋亡檢測試劑盒均購自美國Sigma公司，逆轉錄試劑盒(Fermentas公司)，引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司，EPICS-ALTRA 型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2實驗分組常規培養A549細胞，用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液(內含青霉素100 kU/L、鏈霉素100 mg/L)于37 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度條件下培養，每2～3 d換液傳代 1 次。取對數生長期的A549細胞，以5×107L-1接種于 96 孔板，每孔100 μL。實驗Ⅰ：兩藥同時給藥對A549細胞的影響。待細胞貼壁后分4組處理。對照組加入RPMI 1640培養基；多西他賽單藥組給予含多西他賽(終質量濃度16 mg/L，下同)的培養液；舒尼替尼單藥組給予含舒尼替尼(終濃度7.5 μmol/L，下同)的培養液；舒尼替尼+多西他賽組給予含舒尼替尼和多西他賽的培養液。實驗Ⅱ：兩藥不同順序給藥對A549細胞的影響。多西他賽→舒尼替尼組(D→S組)，先加入100 μL含多西他賽的培養液培養24 h，吸棄培養液后，再加入100 μL含舒尼替尼的培養液繼續培養24 h。舒尼替尼→多西他賽組(S→D組)，先加入100 μL含舒尼替尼的培養液培養24 h，吸棄培養液后，再加入100 μL含多西他賽的培養液繼續培養24 h。

1.3A549細胞增殖抑制率檢測實驗Ⅰ分組細胞按以上分組處理后分別繼續培養24、48、72 h，每組設6個復孔，實驗終止前4 h每孔加入5 g/L MTT 20 μL，置37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中孵育4 h，終止培養，棄上清，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩10 min，在酶標儀上測定570 nm波長處的吸光度(A)，取均值。增殖抑制率=(空白對照孔A-實驗孔A)/空白對照孔A×100%。實驗Ⅱ分組細胞參照以上步驟處理。實驗重復3次。

1.4A549細胞凋亡率檢測實驗Ⅰ分組細胞按以上分組處理后繼續培養48 h后，吸除培養基，胰蛋白酶消化，懸浮液轉移至離心管離心后，去上清，經吹打、收集、離心，冷PBS洗2次后，用1×結合緩沖液重懸細胞(細胞密度1×109L-1)。取100 μL重懸液，加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,輕輕混勻,室溫暗室孵育15 min。每管加400 μL 1×結合緩沖液，1 h內上流式細胞儀,檢測細胞凋亡 (包括早期、晚期和總凋亡率)。同時記錄細胞周期分布。實驗Ⅱ分組細胞參照以上步驟處理。實驗重復3次。

1.5A549細胞中c-met、mek、erkmRNA的表達水平檢測實驗Ⅰ分組細胞按以上分組處理后繼續培養48 h后收集細胞，按Trizol 試劑盒說明提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。實驗所用引物如下。c-met：上游引物為5’-GGTTTTTCCTGTGGCTGAAA-3’，下游引物為5’-CACAACCAAAATGCCCTCTT-3’，目的基因426 bp； mek：上游引物為5’-CCTTGAGGC CTTTCTTACCC-3’，下游引物為5’-ATGTTG GAGGGCTTGACATC-3’，目的基因441 bp；erk：上游引物為5’-CCAGACCATGATCACACAGG-3’，下游引物為5’-CTCGTCACTCGGGTCGTAAT-3’，目的基因441 bp；β-actin：上游引物為5’-TGACGTGGACATC CGCAAAG-3’, 下游引物為5’-CTGGAAGGTGGA CAGCGAGG-3’，目的基因205 bp。擴增條件：95 ℃預變性5 min；95、57和72 ℃各30 s，35個循環(β-actin為30個循環)；72 ℃延伸10 min。取5 μL擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外線投射儀觀察電泳條帶，并用凝膠圖像分析系統進行半定量分析，以目的條帶和β-actin條帶灰度的比值作為該基因mRNA的相對表達量。實驗Ⅱ分組細胞參考以上步驟處理。實驗重復3次。

1.6統計學處理采用SPSS 18.0處理數據。采用析因設計的方差分析比較舒尼替尼和多西他賽單藥給藥及二者聯合給藥時細胞增殖抑制率、凋亡率、細胞周期及3個基因mRNA表達水平的差異，采用兩獨立樣本的t檢驗比較舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對以上指標的影響，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1舒尼替尼和多西他賽單藥及聯合給藥對A549細胞增殖的影響見表1。結果顯示，相對于單獨用藥，多西他賽、舒尼替尼聯合用藥抑制了細胞增殖，且呈時間依賴性。

表1 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯合給藥不同時間A549細胞的增殖抑制率(n=3) %

F多西他賽=17 228.952，F舒尼替尼=17 171.938，F時間=5 048.055，F交互=352.276，F多西他賽×舒尼替尼=6 019.386，P均<0.001。

2.2舒尼替尼和多西他賽單藥及聯合給藥對A549細胞凋亡和細胞周期的影響見表2、3。結果顯示，多西他賽、舒尼替尼聯合用藥較單獨用藥A549細胞晚期凋亡率及總凋亡率均增加，S期細胞減少。

表2 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯合給藥48 h對A549細胞凋亡的影響(n=3) %

表3 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯合給藥48 h對A549細胞細胞周期的影響(n=3) %

2.3舒尼替尼和多西他賽單藥及聯合給藥對A549細胞3個基因mRNA表達水平的影響見表4。結果顯示用藥后c-met、mek mRNA表達下調，erk mRNA表達上調；聯合用藥時erk mRNA表達上調，優于單獨用藥。

表4 舒尼替尼和多西他賽單藥及聯合給藥48 h后3個基因mRNA表達水平(n=3)

2.4舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對A549細胞增殖的影響D→S組細胞增殖抑制率為(81.563±0.628)%，高于S→D組的(64.126±1.600)%(t=13.554,P=0.005)。

2.5舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對A549細胞凋亡及細胞周期的影響見表5、6。結果顯示D→S組與S→D組早期、晚期及總凋亡率均有差異；D→S組較S→D組G2/M期、S期細胞增多，G0/G1期細胞減少。

2.6舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對A549

細胞c-met、mek、erkmRNA表達水平的影響見表7。結果顯示D→S組較S→D組c-met、mek mRNA表達水平下調，erk mRNA表達水平上調。

表5 舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對A549細胞凋亡的影響(n=3) %

表6 舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對A549細胞細胞周期的影響(n=3) %

表7 舒尼替尼和多西他賽不同順序給藥對3個基因mRNA表達水平的影響(n=3)

3 討論

舒尼替尼是一種多靶點的酪氨酸激酶抑制劑,能同時抑制多條信號傳導通路，具有抗腫瘤生長和抗血管生成作用，最終影響惡性腫瘤的生長、增殖和轉移。多西他賽是一種紫杉烷類化合物。多西紫杉醇已被證明能夠在體外抑制血管內皮細胞生長和毛細血管的形成，且呈劑量依賴性[6]。

該研究結果顯示舒尼替尼與多西他賽均能誘導A549的凋亡。MTT法檢測結果顯示，不同的給藥組合和次序對A549細胞增殖的影響不同，其中聯合用藥對細胞增殖的抑制作用大于單獨用藥，不同順序給藥中D→S方式優于S→D方式。

流式細胞術分析結果顯示：舒尼替尼和多西他賽對于細胞凋亡和細胞周期的影響不同，聯合用藥誘導的晚期及總凋亡率均高于單藥，且S期細胞減少；D→S方式誘導的早期凋亡率高于S→D方式，晚期和總凋亡率也有所差異。細胞周期分析則顯示與S→D方式比較，D→S方式作用后，細胞多阻滯于G2/M期、S期，G0/G1期細胞減少。

c-met為肝細胞生長因子受體，具有酪氨酸激酶活性，與多種癌基因產物和調節蛋白相關，參與細胞信號傳導、細胞骨架重排的調控，是細胞增殖、分化和運動的重要因素。c-met/ras/raf/mek/erk信號通路是一個小GTP結合蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞質蛋白激酶的級聯反應，是眾多MAPK通路中的一個。MAPK通路的核心包括3種蛋白激酶：①MAP-KKK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，raf為重要的一員。②MAPKK具有磷酸化蘇/酪氨酸殘基的雙特異功能，mek為重要的一員。③MAPK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，erk為重要的一員。受體酪氨酸激酶發生羧基端過度磷酸化，刺激ras-GDP轉換為ras-GTP，從而導致ras激酶過度活化[7-8]，活化的raf 進一步磷酸化激活mek，活化的mek激活erk，最后活化的erk激活或失活多種靶蛋白。c-met/ras/raf/mek/erk持續激活，最終導致異常細胞增殖及腫瘤形成。

RT-PCR結果顯示，與S→D方式比較，D→S方式作用后，細胞c-met、mek mRNA表達水平明顯下調，erk表達水平明顯上調。推測多西他賽先激活下游信號erk，使之磷酸化[9-10]，隨之舒尼替尼抑制這些信號，從而增加了細胞對舒尼替尼的敏感性。

總之，舒尼替尼和多西他賽能夠抑制A549細胞增殖，誘導A549細胞凋亡，二藥聯用有交互作用；二藥不同順序給藥時，D→S優于S→D的給藥方式。以上結果顯示，靶向藥物與化療存在最佳的給藥順序，先化療后給予靶向藥物可能會獲得更好的臨床效果。然而，舒尼替尼作為一種多靶點的藥物，抗腫瘤機制復雜。該研究尚未探索舒尼替尼與多西他賽不同順序給藥對實體瘤的影響，今后仍需開展更加深入的研究。

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