肺癌患者RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化檢測*

賈要麗，吳擁軍，吳秋歌，張 佳，馬東波，吳逸明，王 靜#

1)鄭州大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科 鄭州 450052 2)鄭州大學公共衛生學院毒理學教研室 鄭州 450001

許多國家肺癌的發病率及病死率呈上升趨勢，目前肺癌已成為腫瘤死亡的首要原因。在中國，肺癌的發病率居各類惡性腫瘤之首[1-2]；Ⅰ期肺癌的5 a生存率為60%，但是Ⅱ～Ⅳ期的5 a生存率最多至40%，最低還不到5%[3]。因此，提高肺癌的生存率依賴于肺癌的早期診斷，篩選和挖掘有價值的早期肺癌的生物學標志物成為亟待解決的問題。腫瘤細胞可以釋放DNA，使外周血清中含有豐富的DNA[4]，在肺癌患者的血液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液中均可發現易感基因啟動子區發生了高甲基化[5]。作者通過實時熒光定量甲基化特異PCR(real-time methylation specific PCR，qMSP)[6]檢測肺癌患者和健康對照者外周血RASSF1A和FHIT基因啟動子區的甲基化情況，以期為肺癌的早期診斷提供幫助。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2011年4月至2012年4月在鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科、胸外科住院的肺癌患者200例。男143例，女57例；年齡26～83(59.6±10.6)歲；組織學類型：鱗癌87例，腺癌72例，小細胞肺癌33例，大細胞肺癌8例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期55例，Ⅲ、Ⅳ期145例；吸煙者107例，不吸煙者93例；所有患者均經病理學證實，并且排除了其他多種腫瘤的可能。200例正常對照取自同期鄭州大學第一附屬醫院體檢科體檢正常的人群。男151例，女49例；年齡26～96(53.7±13.4)歲；吸煙者79例，不吸煙者121例；所有正常對照均未發現肺部或者其他器官的惡性腫瘤。抽取2組受試者晨起空腹肘靜脈血5 mL，置于-80 ℃保存。

1.2DNA提取和引物設計常規提取外周血基因組DNA，操作步驟嚴格按照上海萊楓公司全血基因組DNA提取試劑盒說明進行，用紫外分光光度計測量DNA的濃度和純度，DNA溶液放于-20 ℃冰箱保存待用。RASSF1A和 FHIT基因啟動子區的引物序列[7-8]見表1。引物由上海生工生物工程服務有限公司合成。

1. 3DNA甲基化的qMSP檢測

1.3.1 DNA亞硫酸氫鹽處理 基因組DNA的甲基化修飾應用Intergen CpGenome DNA修飾試劑盒(Qiagen公司)，1 μg 的DNA通過 NaOH變性，再通過亞硫酸氫鈉修飾，50 ℃避光水浴過夜，未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，修飾后的DNA通過乙醇沉淀回收并重懸于去離子水中，用于PCR。

1.3.2 PCR擴增 甲基化和非甲基化RASSF1A基因啟動子區擴增的 PCR反應體系：2×SYBY qPCR Master Mix(美國Promega公司)10 μL，上下游引物各0.5 μL，亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板5 μL，補水至20 μL；甲基化和非甲基化FHIT基因啟動子區擴增的 PCR反應體系：2×SYBY qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板4 μL，補水至20 μL。以經過亞硫酸氫鹽處理后的胎盤DNA作為未甲基化的陰性對照；以經過甲基轉移酶處理后，再經過亞硫酸氫鹽處理的胎盤DNA作為甲基化的陽性對照。PCR擴增完成后，通過熔解曲線計算擴增產物的大小，每一個熒光定量PCR循環后會得到一個Ct值，樣本甲基化水平用甲基化率表示：甲基化率=1/(1+2)-ΔCt×100%(ΔCt=Ct非甲基化-Ct甲基化)[9]。每個樣本均做2個平行樣，每次甲基化分析過程中均有2個空白對照。

表1 引物序列

1.4統計學處理采用SPSS 16.0處理數據，連續性變量因數據不符合正態分布所以采用中位數(M)和上、下四分位數(P25、P75)描述。2組外周血RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化率，不同臨床病理特征的肺癌患者外周血RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化率的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化率與肺癌危險性的評估采用logistic回歸分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組外周血RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化率比較見表2。

2.2不同臨床病理特征的肺癌患者外周血RASSF1A和FHIT基因啟動子甲基化率見表3。

表2 2組外周血RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化率的比較 %

表3 不同臨床病理特征的肺癌患者外周血RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化率 %

2.3RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化率與肺癌危險性的關系隨著RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化率增加，患肺癌的危險性增加(表4)。

表4 RASSF1A和FHIT基因甲基化水平與肺癌危險性的logistic回歸分析

經過性別、年齡和吸煙水平的調整。

3 討論

啟動子區域 CpG島基因啟動子區甲基化出現在許多惡性腫瘤的發病機制中。外周血中DNA甲基化水平的變化已被證明與包括肺癌在內的多種惡性腫瘤有關[10-12]。研究[10]發現重度吸煙者非肺癌患者中度和重度不典型增生組織中也發現存在FHIT基因的甲基化，提示FHIT基因啟動子區甲基化存在肺癌發生的早期。

該研究結果表明肺癌組的RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化率高于正常對照組，提示RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化可能和肺癌的發生相關，這和之前的研究[10]一致；該研究結果表明性別、年齡、吸煙史、肺癌的組織學類型及臨床分期對RASSF1A和FHIT基因啟動子區的甲基化水平沒有影響，與之前的報道[13]一致；也有些研究[14-15]表明年齡、吸煙和組織學類型與RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化改變密切相關，因此，還需要擴大樣本進一步探討。該研究結果同時顯示RASSF1A和FHIT基因啟動子區的甲基化水平與肺癌的危險性相關，隨著基因啟動子區甲基化水平的增加，患肺癌的危險性增加，表明RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化是肺癌的危險因素，檢測患者外周血RASSF1A和FHIT基因的甲基化水平可能有助于肺癌的危險性預測。

綜上所述，RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化和肺癌的早期診斷相關，采用qMSP檢測外周血中RASSF1A和FHIT基因啟動子區甲基化水平可能有助于肺癌的早期預警。

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