鱉甲煎丸及羅格列酮藥物血清對大鼠肝星狀細胞TβRⅡ和Smad3mRNA表達的影響*

河北醫科大學第二醫院

王宇涵 孫玉鳳 王 卜△ 張藝凡△△ 王會青△△△ (石家莊050000)

肝纖維化是慢性肝損傷的病理特征之一。肝星狀細胞(HSC)的活化是肝纖維化發生的核心環節，TGF－β1 是最重要的促進HSC 活化增殖的細胞因子和最強的促ECM 生成因子。［1］TGF－β1 與TβR－I、TβR－Ⅱ等受體結合發揮生物學效應，是TGF－β1 信號轉導的起點和關鍵。［2］Smads 蛋白是目前已知唯一的TGF－β1 跨細胞膜傳入HSC 細胞核的下游底物，［3］其中Smad3 與肝纖維化關系更為密切。［4］羅格列酮為PPAR－γ 合成配體，已證實在肝星狀細胞由靜止表型向活化表型的轉化中起重要作用。鱉甲煎丸為中藥消癥化結之名方，但其具體作用靶點及途徑尚未明確。本實驗采用血清藥理學方法，配制含藥物血清的干預培養基作用于體外培養的大鼠HSC，并運用RT－PCR 檢測方法觀察不同濃度鱉甲煎丸和羅格列酮藥物血清對TGF－β1－Smad 信號轉導通路最為關鍵的兩個位點:TβR－Ⅱ和Smad3mRNA表達水平的影響，明確鱉甲煎丸和羅格列酮抗肝纖維化效果及可能作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SD 雄性大鼠25 只購自河北省實驗動物中心(合格證編號:1008093)，體質量200 g±20 g，按清潔級大鼠的飼養要求適應性喂養至平均體質量250 g±30 g。

1.2 實驗藥物及試劑 鱉甲煎丸水蜜丸購自武漢中聯藥業集團股份有限公司，羅格列酮片(愛能)購自成都恒瑞制藥。TGF－β1 購自Peprotech 公司，反轉錄及RT－PCR擴增試劑盒購自Fermentas 公司，DNA Marker 購自上海捷瑞生物工程有限公司，PCR 引物由上海捷瑞生物工程有限公司鑒定并合成。

1.3 主要儀器 CHK2－F－GS 顯微鏡(日本Olympus公司)，二氧化碳培養箱 (Reveo Scientifics Fac 公司)，Nano Drop ND－1000 超微量紫外分光光度計(美國Nanodrop 公司)，DYY－12 型電腦三恒多用電泳儀和DG－3A 型水平電泳槽(北京市六一儀器廠)，GBOX－HR 凝膠成像分析儀(美國UVP 公司)，C1000TM 梯度基因擴增儀(德國Biometra 公司)。

2 方法

2.1 各實驗組藥物血清及干預培養基的制備 25 只按體質量隨機分為5 組。西藥組灌服相當于成人千克體質量日用量7 倍的羅格列酮溶液(濃度為45.5 μg/mL)，中藥低、中、高劑量組分別灌服相當于成人千克體質量日用量3.5、7、14 倍的鱉甲煎丸溶液(濃度分別為26.25 mg/mL、52.5 mg/mL、105 mg/mL)，每只大鼠每次灌胃2 mL，每日2次，對照組灌服相應劑量的蒸餾水。每次灌胃間隔12 h，連灌7 次，第7 次給藥前禁食12 h，給藥后1 h 無菌條件下每只下腔靜脈取血后分離血清，過濾除菌后56℃滅活30 min。用10%FBS－DMEM 培養液配置大鼠含藥血清體積分數為0.1 的各實驗組干預培養基:含正常大鼠血清的FBSDMEM 培養液為對照組干預培養基，含正常大鼠血清的FBS－濃度5 μg/L TGF－β1［5］的DMEM 培養液為模型組干預培養基，含羅格列酮藥物血清的FBS－DMEM 培養液作為西藥組干預培養基，含鱉甲煎丸低、中、高劑量藥物血清的FBS－DMEM 培養液分別作為鱉甲煎丸低、中、高劑量組干預培養基。

2.2 細胞培養傳代及分組 肝星狀細胞系HSC－T6 由河北醫科大學第二醫院消化病研究所惠贈。HSC 復蘇后，培養傳代2～3 次，制備細胞懸液，均勻接種于18 個細胞培養瓶，將實驗分為6 組，每組3 瓶細胞。在5%CO237℃細胞培養箱中培養至細胞近50%匯聚時，換用不含血清的DMEM 同步化處理24 h，棄上清，對照組加入配制好的對照組干預培養基4 mL，模型組和各治療組加入模型組培養基4 mL 24 h 后，吸去上清液，分別加入對照組和各治療組干預培養基4 mL，5%CO237℃細胞培養箱中培養24 h。

2.3 用RT－PCR法檢測各實驗組HSCTβR－Ⅱ，Smad3mRNA 表達 按試劑盒說明，以Trizol 試劑提取各實驗組總RNA。根據試劑盒說明進行RT－PCR (Fermentas 公司)。引物序列如下:TβR－Ⅱ:F:5＇－GGAAGTCTGCGTGGCCGTGTGG－3＇R:5＇－CTATGGCAATCCCCAGTGGAGG－3＇，擴增產物長度為299 bp。Smad3:F:5＇－TGACAGTGCTATTTTCGTCCAGTCT－3＇R:5＇－CGATCCCTTTACTCCCAGTGTCT－3＇擴增產物長度為375 bp。每個反應體系加入1 μg RNA，采用C 1000TM 梯度基因擴增儀(德國Biometra 公司)，按各自反應條件進行擴增，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，GBOX－HR 凝膠成像分析儀進行吸光度掃描，用目的基因的吸光度與內參GAPDH 吸光度的比值代表目的基因的相對表達含量。每個樣本每個指標重復做3 次，取其均值。

2.4 統計學處理 應用SPSS16.0 統計分析軟件進行統計分析，數據以均數±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)，進一步兩兩比較采用SNK法。P＜0.05 即認為組間差異有顯著性。

3 結果

各組肝星狀細胞TβR－Ⅱ、Smad3mRNA 表達結果顯示:與對照組相比，模型組及各藥物干預組TβR－Ⅱ、Smad3mRNA 表達均明顯增高(P﹤0.05);與模型組相比，各藥物干預組TβR－Ⅱ、Smad3mRNA 表達均明顯減低(P﹤0.05);與羅格列酮組相比，鱉甲煎丸高劑量組TβR－Ⅱ、Smad3mRNA 表達均明顯減低(P﹤0.05)，鱉甲煎丸中劑量組TβR－Ⅱ、Smad3mRNA 表達差異無顯著性(P﹥0.05)，鱉甲煎丸低劑量組TβR－Ⅱ、Smad3mRNA 表達均明顯增高(P﹤0.05);鱉甲煎丸低、中、高劑量組TβR－Ⅱ、Smad3mRNA 表達均依次減低(P﹤0.05)，詳見圖1～圖3、表1。

圖1 RT-PCR 檢測各組大鼠HSC 中TβR-ⅡmRNA 電泳條帶

圖2 RT-PCR 檢測各組大鼠HSC 中Smad3mRNA 電泳條帶

圖3 RT-PCR 檢測各組大鼠HSC 中GAPDHmRNA 電泳條帶

表1 各組大鼠HSC 中TβR-ⅡmRNA、Smad3mRNA表達水平的比較 (±s)

表1 各組大鼠HSC 中TβR-ⅡmRNA、Smad3mRNA表達水平的比較 (±s)

注:與對照組比較，△P﹤0.05;與模型組比較，□P﹤0.05;與鱉甲煎丸低劑量組比較，▲P﹤0.05;與鱉甲煎丸中劑量組比較，●P﹤0.05

組別 n Smad3/ GAPDH TβR－Ⅱ/GAPDH對照組 3 0.329±0.013□ 0.382±0.037□模型組 3 0.810±0.012△ 1.030±0.042△羅格列酮組 3 0.545±0.015△□ 0.719±0.038△□鱉甲煎丸低劑量組 3 0.636±0.011△□ 0.825±0.033△□鱉甲煎丸中劑量組 3 0.567±0.008△□▲ 0.687±0.042△□▲鱉甲煎丸高劑量組 3 0.445±0.015△□▲●0.473±0.036△□▲●

4 討論

肝纖維化(HF)是肝臟持續損傷組織發生、修復時因ECM 合成、降解與沉積平衡破壞所致的病理過程。HSC 是肝纖維化時ECM 過多產生和沉積的關鍵。TGF－β1 是已知最為關鍵的致纖維化細胞因子，也是HSC 的激活、增殖，ECM 的合成分泌是這一病理過程中重要的生物調節因子。［6］TGF－β1 首先通過與細胞膜上的TβRⅡ結合，激活TβRⅠ，而后形成異源四聚體復合物發揮以上生物效應。從異源四聚體而致的信息，是通過胞質內被稱為Smad 的信號分子活化而實現的，而smad3 是包括肝纖維化在內的TGF－β1 相關致病機制中的關鍵物質。

中藥復方鱉甲煎丸具有活血化瘀，軟堅散結，滋陰清熱等作用，改善血液循環，增加肝內循環血量，抑制肝內纖維增生，促進膠原纖維降解吸收，改善肝功能;亦能直接抑制肝內膠原的沉積，從而減緩肝纖維化的發生;羅格列酮為PPARr 激動劑，通過上調PPARr 抑制HSC 增值活化，增加ECM 降解，促進HSC 凋亡，逆轉肝纖維化。［7］

本實驗結果證實TGF－β1 促HSC 增殖活化的作用與在各位點激活TGF－β1－Smad 信號轉導通路有關。羅格列酮，鱉甲煎丸藥物血清均能下調由TGF－β1 刺激后的HSC表達TβR－Ⅱ，Smad3mRNA，說明兩藥抑制HSC 增殖活化的作用均與在以上兩個位點阻斷TGF－β1－Smad 信號轉導通路有關。但其對下游因子Smad3 的作用是對上游因子TβR－Ⅱ作用產生的級聯反應，還是直接與Smad 發生反應，亦或兩者兼而有之，有待進一步研究探討。本實驗進一步證實中藥鱉甲煎丸抗肝纖維化效果確切且呈顯著量效關系，為其進一步科學研究和臨床應用奠定基礎。

［1］Knittel T，Mehde M，Kobold D，etal.Expreeion patterns of Matrix metallo proteinases and their inhibitors in parenchy－mal and non－parenchymal cells of rat liver:regulation by TNF－alpha and TGF－beta I ［J］.Hepatol，1999，30:48

［2］Qi Z.Atsuchi N，Ooshima A，Tokeshita A，UenoH，etal.Blockat e of type beta transforming growth factor signaling prevents liver fibrosis and dysfunction in the rat［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96 (5):2 345－2 349

［3］Bassing CH，Yingling JM，Howe DJ，etal.A transforming growth factor beta type I receptor that signals to activate gene expression［J］.Science，1994，263 (5143):87－89

［4］Dijke PT，Goumans MJ，Itoh F，etal.Regulation of cell proliferation by Smad.proteins ［J］.Cell Physiol，2002，191 (1):1－16

［5］Zhang Z，Garron TM，LiXj，etal.Recombinant human decorin inhibits TGF－beta1 induce contraction of collagen lattice by hypertrophic scar fibroblasts.Burns 2007，33:634－41

［6］Bissell DM，Roulot D，George J.Transforming growth fact or beta and the liver［J］.Hepatology，2001，34 (5):859－867

［7］Miyahara T，Schrum L，Rippe R，etal.Peroxisome proliferatoractivated recptors and hepatic stellate cell activation ［J］.Biol Chem，2000，275 (46):35 715－35 722