中華鱉“腐皮、癤瘡”并發癥致病菌的病原分離與藥敏試驗分析

曾 丹,鐘 蕾,羅方興,肖宗琳,謝偉偉,肖克宇 1

(湖南農業大學動物科學技術學院, 中國 長沙 410128)

中華鱉(Trionyxsinensis)，俗稱鱉、甲魚、王八、腳魚、水魚等[1]．是一種名貴的水生經濟動物，其食用與藥用價值較高，在醫學上具有滋陰壯陽、利肝益腎、清熱消淤、破結軟堅等功能[2]．中華鱉在我國廣泛分布，除新疆、西藏和青海外，其他各省均產．國外分布于越南、日本、帝汶島及夏威夷群島等地[3]．中華鱉的人工溫室養殖由于集約化程度高，養殖密度大，很容易滋生病菌，引起疾病發生[4]．譚北平[5]、姚金水[6]、李占魁[7]等研究了中華鱉腐皮病的病理組織、病原及防治方法．張開字[8]、雷道啟[9]、陳含華[10]等研究中華鱉癤瘡病得出控制溫度、養殖密度、水質等因素是預防此病的有效措施．以上研究表明，中華鱉腐皮病的主要癥狀是頸部、尾部、背甲邊緣等處皮膚發生糜爛、壞死 ；中華鱉癤瘡病的主要癥狀是患病初期病鱉四肢基部、裙邊、腹甲、背甲以及脖頸長出白色小粒癤瘡，病情加重后癤瘡向外凸起，繼而潰爛成凹陷，炎癥進一步擴散，嚴重時出現孔洞狀，可以見到內臟．

本研究從湖南湘陰縣某養殖場采回的中華鱉病樣中，發現其均具有明顯的腐皮和癤瘡病癥狀，盡管目前對中華鱉癤瘡病、腐皮病的病因、發病規律和防治技術等方面的研究報道較多，但依地域和養殖環境的不同，其病原亦有差別，且有關中華鱉癤瘡、腐皮并發癥的病原分離與鑒定的報道少見．本實驗對導致中華鱉癤瘡病、腐皮病并發癥的致病菌進行了病原分離、生化鑒定和藥敏試驗，檢測出致病菌的耐藥性，為有效防治中華鱉腐皮、癤瘡并發癥提供一定的理論依據．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料 取湖南省湘陰縣某中華鱉養殖場吊養的已呈明顯發病狀況且頻死的20個中華鱉，體重在0.1～1 kg之間．頭尾長0.18±0.02 m，寬0.09±0.01 m．確定患病中華鱉的標準：縮頭緩慢、背腹部斑塊、糜爛或孔洞等癥狀明顯．

1.1.2 培養基 營養瓊脂培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g，H2O 1 L，pH 7.0．

1.2 方法

1.2.1 癥狀觀察與組織涂片 對采集的中華鱉病樣進行肉眼觀察并解剖，記錄其主要癥狀．組織涂片后采用美蘭染色，顯微鏡油鏡觀察和顯微攝像．

1.2.2 病原菌分離 用接種環在病鱉腹部、背部和內臟等病灶部位挑取組織液或內臟勻漿液，分別在普通營養瓊脂平板上劃線接種, 于28 ℃恒溫培養24 h, 選取單個菌落接種于斜面, 再進行平板劃線, 將分離到的細菌進行純培養，保存至斜面備用．

1.2.3 分離菌的菌落形態觀察及染色 對培養出的細菌菌落進行觀察,并對其大小、形態、顏色、隆起度等特征進行記錄．對分離純化的上述培養菌進行革蘭氏染色,顯微鏡觀察細菌的個體形態及染色特征．

1.2.4 分離菌的生理生化特性檢查及菌種鑒定 采用API-20E鑒定系統和菌種鑒定管對純化菌株進行生理生化指標的測試(湖南天地人生物有限公司完成)，并人工補充其他的生理生化實驗．細菌的生理生化試驗按《常見細菌系統鑒定手冊》[11]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[12]方法進行．

1.2.5 人工感染試驗 將16 h的細菌培養物用質量分數為0.70%的無菌鹽水制成菌懸液，選取0.4 kg左右健康的中華鱉各10尾，分別進行腹腔注射感染和創傷浸泡感染,每尾腹腔注射劑量為0.5 mL, 菌液濃度稀釋為1.0×109個/mL, 同時以注射等量無菌生理鹽水的健康中華鱉作為對照；創傷浸泡感染先用滅菌針頭在中華鱉背腹部和腿部劃痕, 再將其放置在含有2.0×109個/mL病原菌的水體中浸泡24 h, 然后在裝有清水的水族箱中進行飼養觀察，同時對照組用清水浸泡．水溫控制在25～28 ℃，連續14 d觀察并記錄試驗中華鱉的病癥及死亡數目, 計算其死亡率．同時對人工感染發病瀕死的中華鱉進行病原菌再分離, 檢查所分離的菌株與原分離菌株在形態與理化特性等方面是否一致．

1.2.6 藥物敏感試驗 將從患病中華鱉中分離出的菌株用無菌水調配成(1.0～1.5)×108個/mL的菌懸液(相當于0.5麥氏單位濃度)．取菌懸液 0.1 mL 放于無菌平皿中央，用涂布棒涂勻．在涂菌平板上均勻粘貼抗生素藥敏紙片，每皿貼5～6片不同的藥皿紙片，片間距離不少于 24 mm，紙片中心距平板邊緣不少于 15 mm．將貼有藥敏片的平板放于28 ℃的恒溫生化培養箱里培養 24 h，取出后測量各個抑菌圈直徑．根據抑菌圈直徑大小結合《藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準》判斷細菌對藥物的敏感性．藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司．由長沙天地人生物有限公司鑒定并提供結果．

2 結果

2.1 癥狀觀察

觀察自然發病和人工感染發病的中華鱉，發現其癥狀基本類似，主要為腿部和裙邊出現明顯紅腫、糜爛，腹甲、背甲以及脖頸長出白色小粒癤瘡，病情加重后癤瘡向外凸起，繼而潰爛成凹陷呈現孔洞狀，解剖可見腹腔積水，內臟充血，肝臟明顯腫大(如圖1)．

2.2 美蘭染色鏡檢結果

分別從患該病中華鱉的背甲、腹甲、肝臟、脾臟等處取樣，用病變組織涂片進行美蘭染色和光學顯微鏡鏡檢，發現有大量細菌存在(見圖2)．

(a)背部潰瘍和癤瘡；(b)腹部白色突出物；(c)肝臟明顯腫大；(d)腹腔積水 (a)背甲；(b)腹甲；(c)肝臟；(d)脾臟圖1 發病中華鱉的體表和內臟病變(箭頭所示) 圖2 病變組織美蘭染色鏡檢結果(10×40)Fig.1 The body surface and viscera lesions of infected trionyx sinensis Fig.2 Lesions methylene blue staining microscopic examination results

2.3 分離菌的菌落形態及染色結果

從患病中華鱉的內臟、四肢和背腹甲中共分離篩選得到2個優勢菌株，分別標記為Z2012-1和Z2012-2．革蘭氏染色顯示兩者均為革蘭氏陰性短桿菌菌落形態(見表1)．

表1 Z2012-1和Z2012-2的菌落形態特征Tab.1 Colony shape features of Z2012-1 and Z2012-2

2.4 分離菌株的生理生化特性

根據細菌的形態特征，人工生化試驗結果以及長沙天地人生物有限公司生化鑒定儀鑒定結果，將Z2012-1和Z2012-2菌株的生化特征匯總于表2，參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》，確定Z2012-1和Z2012-2菌株分別為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和洛菲不動桿菌(Acinetobacterlwoffi)．

表2 生理生化反應Tab.2 Isolates physiological and biochemical reactions

2.5 人工感染試驗結果

用兩種菌1∶1混合感染健康中華鱉，經腹腔注射和浸泡感染進行試驗，試驗鱉均出現病癥，其中腹部注射發病較快，第6天出現死亡，連續觀察15天死亡率達100%；而浸泡感染發病較慢，中華鱉先是行動遲緩，體表出現小白點，然后停止進食，直至第10天陸續出現死亡，死亡率為60%(表3)．經解剖觀察，患病中華鱉出現與正常養殖中發病中華鱉(圖1)相似癥狀，病鱉體表多處潰瘍和癤瘡、肝臟腫大充血，并伴隨大量腹水從體內流出．從人工感染瀕死的中華鱉體內又分離到與原分離菌株形態特征及生理生化特性一致的細菌．

表3 健康中華鱉人工感染結果Tab.3 Results of artificial infection to healthy trionyx sinensis

2.6 藥敏實驗結果

從表4可以看出，嗜水氣單胞菌對頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、環丙沙星、左氟沙星、美洛培南、復方新諾明、氯霉素等藥物高度敏感，對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩等藥物中度敏感，對四環素、頭孢西丁等藥物具有耐藥性．洛菲不動桿菌對頭孢他啶、頭孢曲松、左氟沙星、氧氟沙星、美洛培南、米諾環素、復方新諾明、氯霉素等藥物高度敏感，對氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、粘菌素等藥物中度敏感，對哌拉西林、環丙沙星、慶大霉素等具有耐藥性．

表4 藥敏試驗結果Tab.4 The results of sensitivity test of antibacterial drugs

3 討論

目前國內外學者對引起中華鱉“腐皮、癤瘡”并發癥的主要致病菌的研究有一些，但尚未深入．近年來國內學者陸續報道不動桿菌可與嗜水氣單胞菌等細菌混合感染水產動物，引起各種疾病．嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬弧菌科,為革蘭氏陰性短桿菌，對環境要求不高，廣泛分布在江、河、湖中，是魚類、兩棲類、爬行類和哺乳動物的致病菌[13-14]．它能引發多種水生動物的傳染病,有關嗜水氣單胞菌致病性的研究，已有過大量的報道[15]．但有關洛菲不動桿菌在中華鱉細菌性疫病中出現的頻率和致病機理尚未見報道．洛菲不動桿菌也稱魯氏不動桿菌，為條件致病菌，廣泛分布于土壤、水體和污水中．一般認為不動桿菌的毒力很低，在機體抵抗力下降或免疫功能受損時易出現感染．在水產動物病害中, 洛菲不動桿菌可引起歐洲鰻鱺“紅頭病”[16]、胡子鲇“吊頭病”[17]、金魚“突眼病”[18]、鱖魚的某種細菌病[19]、美國青蛙“抽搐癥”[20]等．而本研究中由嗜水氣單胞菌和洛菲不動桿菌感染引起中華鱉癤瘡、腐皮并發癥的報道，在國內尚屬首次．

本實驗從病鱉體平板劃線法分離出致病菌，培養后進行形態學觀察，對致病菌進行生理生化鑒定．再對致病菌進行藥敏試驗，檢測出致病菌對不同藥物的耐藥性情況．試驗表明，嗜水氣單胞菌和洛菲不動桿菌這2種病原菌對頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、左氟沙星、美洛培南、阿米卡星、米諾環素、復方新諾明、氯霉素等藥物敏感，對四環素、哌拉西林、慶大霉素不敏感，這對以后中華鱉集約化養殖過程中疾病的預防與治療提供理論基礎．

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