一種快速鑒定豬舍空氣樣品中金黃色葡萄球菌的方法

柳敦江, 王 鵬

（1.大北農集團動物保健技術研發中心，北京 101407 ；2.南京市畜牧家禽科學研究所，南京 210036）

金黃色葡萄球菌是自然界中常見的一種革蘭氏陽性菌,其產生耐熱核酸酶，凝固酶，腸毒素等使其致病力很強，污染食物常引起食物中毒等，在這方面其危害僅次于沙門氏菌與溶血弧菌[1]，同時近年來，由于養殖環境中各種抗生素的濫用，導致各種耐藥金黃色萄萄球菌的產生，甚至出現了耐各類抗生素的“超級細菌”[2]。有人曾把肝炎、艾滋病與金黃色葡萄球菌并稱為世界上三大難治的傳染性頑病[3]，所以迅速采集、鑒定各個不同環境中存在的金黃色葡萄球菌，并對其做耐藥和毒力方面的研究，從而掌握各個地區金黃色葡萄球菌的耐藥性其傳播的研究至關重要 ，金黃色葡萄球菌的傳統培養基一般都是針對其培養特性而設計[4]，如高鹽甘露醇是針對其耐鹽，產酸的特點，而Baired-Parker 培養基是其鑒別培養基，通過抑制別的細菌生長且還原亞碲酸鹽而鑒別，而凝固酶試驗則是根據其是否產生凝固酶使血漿凝固而進行判斷，這些試驗都是建立在生化反應的基礎之上，但是往往伴隨著假陽性與假陰性的產生，而且此方法耗時較長，需要3～5 d 的時間 ，并且易導致漏檢或檢出錯誤，常見的鑒定金黃色葡萄球菌的試驗有革蘭氏染色鏡檢，凝固酶試驗，凝集反應等采用免疫學檢測方法如乳膠凝集試驗和ELISA，雖可縮短檢測時間，但是由于其工作原理是抗原抗體的中和反應，因此會受到食物成分及葡萄球菌A 蛋白的影響。

顯色培養基的面世是對傳統檢測手段的一個突破，一種基于對微生物的產酶特性認識不斷深化而設計的一種新型培養基產品，顯色培養基在選擇性培養基中加入目標微生物特征性酶的顯色底物，將微生物的選擇性培養和特征性酶的測試聯合在一起。當目標微生物在培養基上生長時，其特征性酶就能降解顯色底物并產生帶有特殊顏色的代謝物，使菌落形成特定的顏色[5]。而干擾菌或被抑制，或不產生特征性酶而不顯色，因而能被區別 。當顯色培養基上生長菌落之后只要通過簡單的菌落顏色形態觀察或簡單試驗就能確定。

金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶是一種熱穩定性的DNase,通常被認為是金黃色葡萄球菌的重要標志[6-7]，有國外學者研究表明耐熱核酸酶與致病性的金黃色葡萄球菌的符合率為98.3%[8]。國外已將檢測耐熱核酸酶作為致病性金黃色葡萄球菌的篩選手段，所以編碼耐熱核酸酶的基因也就成為PCR 技術檢測金黃色葡萄球菌的首選靶基因。通過對金黃色葡萄球菌中的nuc 基因中的保守片段設計引物進行擴增可以鑒別金黃色葡萄球菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基

金黃色葡萄球菌顯色培養基（青島海博生物），普通營養瓊脂（杭州天和）。

1.1.2 測試菌株

金黃色葡萄球菌ATCC25923 由山東農業大學趙宏坤老師實驗室贈，表皮葡萄球菌,傷寒沙門氏菌,大腸桿菌，巴氏桿菌，糞腸球菌，鏈球菌，單增李斯特氏菌皆為山東農業大學環境微生物實驗室保藏。

1.1.3 主要試劑和儀器

Andersen-6 級撞擊式空氣微生物采樣器（遼陽市醫療器械廠）。DH 4 000A 型電熱恒溫培養箱（中國天津市泰斯特儀器有限公司），電熱鼓風干燥箱（ZB101 -Ⅰ型，山東淄博儀表廠）無菌超凈工作臺（AIR TECH，蘇凈集團安泰公司制造）。

1.1.4 引物設計

根據NCBI 基因文庫公布的金黃色葡萄nuc 基因序列,查找到nuc 基因的序列號為V01281。

根據Brakstad 等設計的引物序列，nuc 正向5!- GCGATTGATGGTGAT ACGGTT-3′，nuc 反向5′-AGCCA AGCCTTGACGAACTAAAGC-3′，擴增257033-257311 之間的279 bp 的片段。并由大連寶生物合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集

Andersen-6 級撞擊式空氣微生物采樣器在豬場中采集空氣樣品，采樣器的放置高度為70 cm.采樣介質為金黃色葡萄球菌顯色培養基。

1.2.2 樣品的培養

將采樣后的平皿放在37 ℃恒溫箱中培養24 h，觀察平板上生長的菌落，然后挑取藍綠色的可疑菌落接種到普通瓊脂培養基上培養繼續培養18～24 h。

1.2.3 DNA 模板的制備

刮取普通營養瓊脂上生長的菌苔置于盛有150 μL 雙蒸水的1.5 mL 離心管中，放在沸水中煮沸10 min ,11 000 r/min， 離 心1 min, 取上清液，備用 。

1.2.4 反應體系的建立

反應液包括10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，上下游引物各1 uL，模板2 μL，雙蒸水補足50 μL。

1.2.5 擴增反應參數

預 變 性94 ℃ 5 min，變 性94 ℃1 min，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，進行35 個循環，再72 ℃延伸5 min。

1.2.6 電泳條件

1.5%瓊脂，90 V，30～35 min.

1.2.7 確定

將檢出的陽性菌株放在API 20E 標準生化鑒定系統上檢測。

圖1 金黃色葡萄球菌在顯色培養基上的菌落圖

表1 其它對照菌在顯色培養基上的生長狀況及顯色效果

圖2 PCR 產物電泳結果

2 結果分析

2.1 顯色培養基上的檢測結果

金黃色葡萄球菌顯色培養基經恒溫培養24 h 后，顯現出藍綠色（見圖1）。

2.2 PCR 擴增產物特異性的檢測結果

在金黃色葡萄球菌顯色培養基上挑取32 株可疑菌經過PCR 電泳后結果有28 株菌出現279 bp 的條帶，其與PCR的結果吻合度為84.4%（見圖2）。

2.3 標準生化鑒定系統檢測結果

將PCR 產物的陽性結果菌株經API 20E 自動生化鑒定儀檢測后，28 株可疑菌均為金黃色葡萄球菌，而5 株陰性菌株經測有一株為金黃色葡萄球菌，而其余四株均為雜菌。

3 結論

本研究直接從空氣中采集樣品，用金黃色葡萄球菌顯色培養基培養后，利用PCR 技術 ，成功地檢測出空氣中的金黃色葡萄球菌。且檢測準確率極高。目前用傳統的方法來檢測金黃色葡萄球菌，費時費力，一般如果順利的話需要5～6 d 的時間，而單純的用顯色培養基來檢測，由于空氣中的雜菌和其他因素的影響，會產生較高的假陽性，而運用顯色培養基與PCR 方法的結合，則大大降低了金黃色葡萄球菌的檢出錯誤率，且可以大幅度地減少檢出的時間，一般從空氣采樣到檢出2 d 時間就可以完成 ，這為我們快速地檢測醫院及各種公共場合中的金黃色葡萄球菌，并且對其進一步的研究提供了便利，具有極高的潛在應用性。

［1］ 吳仲梁，韓偉，陶軍，等．快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的檢測方法[J]．中國食品工業，2003(6)：56-57．

［2］ 姜延龍，張宇，田波，等.PCR 技術檢測金黃色葡萄球菌進展[J].食品科學，2006（5）：245-249.

［3］ 張琳，李敏，于莉，等.食品中金黃色葡萄球菌檢測方法的比較研究[J].食品工業科技，2006（6）：161-164.

［4］ Gaillot O, Wetsch M , Fortineau N, et al. Evaluation of CHROM agar Staph.aureus, anew chromogenic medium, for isolation and presumptive identification of Staphylococcus aureus from human clinical specimens[J]. Clin. Microbiol.2000.38:1587-1591.

［5］ Silva B O,Caraviello D Z, Rodrigues A C,et al.Evaluation of Petrifilm for the isolation of Staphylococcus aureus from milk samples[J].J Dairy Sci，2005,88(8):3000-3008.

［6］ Lowy F D.Staphylococcus aureus Infections[J].N Engl J Med.1998，339:520-532.

［7］ Ballal A, Ray B, Manna A C.sarZ, a sarA Family Gene,Is Transcriptionally Activated by MgrA and Is Involved in the Regulation of Genes Encoding Exoproteins in Staphylococcus aureus[J].Bacteriol,2009,191: 1656!1665.

［8］ Tatini S R,Cords B R.Gramoli j:Screening for staphylococcal enterotoxins in food[J]. Food Technol,1976，31：64-74.