綿羊肺腺瘤病毒內蒙株衣殼蛋白在真核細胞中的表達

斯日古楞，么宏強，馬學恩，周建華

（1.內蒙古農業大學獸醫學院 農業部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，內蒙古 呼和浩特010018；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，黑龍江 哈爾濱150030）

綿羊肺腺瘤病毒（JSRV）gag基因所編碼的衣殼蛋白（CA）是JSRV的主要核心蛋白，構成病毒粒子雙層殼的內殼－即衣殼，具有疏水性，其氨基酸序列比較保守，在感染晚期對病毒的裝配和出芽發揮重要功能［1］。CA抗原不僅在不同毒株中高度保守，而且在病毒粒子中含量高且容易制備，因此CA蛋白一直被選作為商品化診斷抗原。

使克隆的基因在細胞中表達在理論研究和實際應用中都具有十分重要的意義。克隆的基因只有通過表達才能探索和研究基因的功能以及其表達調控的機理，克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。為了進一步研究CA蛋白的結構和功能等奠定基礎，本試驗中構建其真核表達載體，實現了在真核細胞中的高效表達，并對表達的蛋白進行了有效鑒定。報告如下。

1 材料

1.1 菌株與質粒E.coliDH5α感受態細胞、pcD－NA3.1（＋）真核表達載體等，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供。重組原核表達質粒，本課題組保存。

1.2 細胞 293細胞和Hela細胞，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供。

1.3 抗體 抗HA小鼠單抗（TIANGEN）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG（北京中山金橋生物技術有限公司）；FITC標記的山羊抗小鼠IgG（Sigma公司）。

1.4 培養基 DMEM培養基（Sigma公司）；優級胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技責任有限公司）；0.25%胰酶、2mmol/L L－谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素等均為國產分析純試劑。

1.5 主要試劑 LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑（Invitrogen公司）；質粒提取試劑盒 （Promega公司）；PrimerSTARTMHS DNA聚合酶、5×PrimerST ARTM Buffer、限制性內切酶EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、T4DNA Ligase（寶生物工程（大連）有限公司）；Western Blotting ECL超敏發光液（普利萊基因技術有限公司）；LB培養基及其余生化試劑均為國產或進口的分析純試劑。

2 方法

2.1 重組真核表達載體的構建 重組原核表達質粒經PCR法及EcoRⅠ和SalⅠ限制性內切酶進行雙酶切鑒定，并以其為模板，采用含HA標記序列的引物及PrimerSTARTMHS DNA高保真聚合酶進行PCR擴增。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

膠回收純化的PCR產物和真核表達載體pcDNA3.1（＋），雙酶切純化后，連接轉化入E.coliDH5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素LB平板，37℃培養過夜。提取的重組質粒經PCR及雙酶切鑒定。陽性克隆進行核苷酸序列的測定。

2.2 pcDNA3.1（＋）－CA－HA 在真核細胞中的瞬時表達

2.2.1 轉染真核細胞 將293細胞和Hela細胞用含10%FBS的DMEM培養基，在37℃，5%CO2的條件下，進行貼壁培養2～3d后，再消化傳代培養。轉染前在6孔板每孔鋪5×105個細胞，培養過夜。第2天，采用LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑進行轉染。

2.2.2 檢測pcDNA3.1（＋）－CA－HA 在真核細胞中的表達

2.2.2.1 間接免疫熒光法檢測 將轉染后的細胞培養至35h時，用PBS洗滌，并用預冷的無水乙醇在室溫固定20min；PBS洗滌，將一抗（HA單抗）滴加于固定細胞上，室溫孵育2h；PBS洗滌3遍，每次5min；加入FITC標記山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育1h，PBS洗滌3遍，每次5min。空載體轉染的細胞為陰性對照；未轉染pcDNA3.1（＋）－CAHA質粒的293細胞和Hela細胞為空白對照。倒置熒光顯微鏡下觀察轉染細胞中熒光強度。

2.2.2.2 Western Blotting法檢測 將轉染后的細胞培養至18h、24h、36h和48h時，用PBS洗滌，應用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，進行SDS－PAGE電泳；應用轉膜儀將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜；廢棄封閉液，加入一抗，室溫孵育2h；用TBST洗膜3次，每次5min；再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1h；用TBST洗膜3次，每次5min；加入Western Blotting超敏發光液，用化學發光法在成像儀下曝光檢測目的蛋白的表達情況。

3 結果

重組真核表達載體的構建

3.1.1 CA－HA基因的PCR擴增結果采用PCR法以原核表達質粒（經PCR及雙酶切法鑒定）作為模板，進行擴增目的基因，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，符合預期片段大小585bp，見圖1。

圖1 CA－HA基因的PCR擴增

3.1.2 重組質粒的鑒定 采用PCR、酶切法鑒定重組質粒pcDNA3.1（＋）－CA－HA，之后對陽性的重組子進行序列測定。結果顯示，目的基因序列與原序列完全一致，未發生突變，讀碼框架和插入方向完全正確。

檢測pcDNA3.1（＋）－CA－HA在真核細胞中的瞬時表達

3.2.1 間接免疫熒光檢測結果 重組質粒轉染293細胞和Hela細胞35h后，用倒置熒光顯微鏡檢測，可以看到綠色熒光細胞，且熒光都位于細胞膜，對照無熒光出現，見圖2。此結果證實所克隆的CA基因，在異源啟動子CMV的作用下，在真核細胞中可以表達，而且表達在細胞膜上。

3.2.2 Western blotting檢測結果 轉染后，分別在18、24、36、48h時裂解細胞，裂解產物經 Westhern blotting檢測，結果顯示，在25kDa處可見特異條帶，而對照未檢測到此條帶，見圖3，說明真核表達載體pcDNA3.1（＋）－CA－HA可在真核細胞中已成功表達了CA蛋白。

圖2 間接免疫熒光方法檢測CA－HA基因在293細胞和Hela細胞中的表達

圖3 Western blotting方法檢測在293細胞和Hela細胞中的表達

4 討論

JSRV的衣殼蛋白（CA）是JSRV的主要核心蛋白，構成病毒粒子雙層殼的內殼，它在病毒早期感染與脫衣殼過程中可以穩定未整合的前病毒DNA［2－3］，CA攜帶群特異抗原決定簇，其抗原性十分保守。反轉錄病毒感染細胞后，大多數情況下不會對宿主細胞造成損害，成為隱性感染，目前該病可能發生機制是由于病毒的LTR中所含病毒轉錄的啟動子和增強子影響前病毒DNA插入宿主細胞，激活了宿主細胞的原癌基因，或造成抑癌基因的失活［4－5］。

本試驗中，為了除去原核融合表達蛋白的GST標簽并獲得體外表達的具有類似天然病毒蛋白生物學活性的CA蛋白，構建了CA基因的真核表達載體并進行真核細胞內表達。因無相應的抗體及陽性血清可檢測JSRVCA蛋白的表達，故在設計本試驗時CA基因中融入HA序列，以便于檢測目的基因的表達。經酶切鑒定及測序與預期一致基因序列比較分析結果顯示，沒有發生無義突變，已成功構建了含有CA基因的真核表達載體，并用該載體經脂質體法轉染293細胞和Hela細胞后，通過間接免疫熒光方法及 Western blotting方法檢測證實，該載體可在真核細胞內成功表達外源性目的基因CA，在熒光顯微鏡下，轉基因陽性細胞內外源蛋白CA廣泛分布于細胞膜上，并且 Western blotting檢測結果表明，有特異的蛋白表達。因此，可以認為本試驗所構建的真核表達載體是成功的。本試驗對CA蛋白單克隆抗體進行初步鑒定、篩選，為建立特異性的診斷試劑盒奠定良好的基礎。本結果為進一步研究CA蛋白的結構與功能，以及從分子水平探討CA基因免疫等奠定了理論基礎。

［1］ Tustin R C，Williamson A－L，York D F.Experimental transmission of Jaagsiekte（ovine pulmonary adenomatosis）to goats［J］.Onderstepoort J Vet Res，1988，50：309－316.

［2］ Brown P O.Integration of retroviral DNA［J］.Curr Top Microbiol Immunol，1990，157：19－48.

［3］ Brown P O.Integration［M］.In：Retroviruses（J M Coffin，S H Hughes and H E Varmus，Eds.），New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1997：161－203.

［4］ Deluca C，Kwon H，Pelletier N，etal.NF－K B protects HIV－1infected myeloid cells from apoptosis［J］.Virology，1998，244：27－38.

［5］ Carlson J，Bishop J，Lyon M，etal.Chromosomal distribution of endogenous Jaagsiekte sheep retrovirus proviral sequences in the sheep genome［J］.Journal of Virology，2002，75：4239－4246.