幽門螺桿菌cag1基因缺陷株的構建與鑒定

凌峰，王曉春，陳珵，余敏，朱虹，羅彩鳳，邵世和

(1.江蘇大學基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.昆山市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州215300;3.江蘇大學臨床醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)為人類胃部常見致病菌之一，其感染在世界范圍內流行。H.pylori感染與多種胃腸道疾病的發(fā)生密切相關，如胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤［1］。高致病性H.pylori存在一個細胞毒素相關基因致病島(cytotoxin associated gene pathogenicity island，cag PAI)結構，編碼重要的 H.pylori相關毒力蛋白和1種Ⅳ型分泌系統(tǒng)［2］。該Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的部分蛋白與根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens，A.tumefaciens)的經典Ⅳ型分泌系統(tǒng)——VirB/D4系統(tǒng)存在同源性［3］。目前仍有許多cag PAI基因編碼蛋白僅存在于H.pylori中，且功能未知，cag1基因即為其中之一。

本研究以cag PAI首個編碼基因cag1作為研究對象，擬用同源重組技術構建cag1基因缺陷的自殺質粒;通過電擊轉化細菌，抗性篩選出cag1基因缺陷株，并將其破壞GES-1細胞的能力與野生株進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞株與質粒 H.pylori NCTC11637由中國疾病預防控制中心傳染病研究所張建中教授饋贈，人胃上皮GES-1細胞由江蘇大學周天戟教授饋贈，H.pylori自殺質粒pBluescript SKⅡ(-)載體由韓國國立慶尚大學微生物學教研室Seung-chul Baik教授饋贈。大腸埃希菌(E.coli)DH5α由江蘇大學基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 哥倫比亞培養(yǎng)基、微需氧袋、胰蛋白胨、酵母提取物購自Oxoid公司;小牛血清購自杭州四季青生物工程材料生物公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、SDS購自國藥集團化學試劑有限公司;平衡酚、RNA酶購自Generay生物公司;1 000 bp DNA標準參照物、限制性核酸內切酶EcoR I、BamH I、Kpn I、Xho I購自 Thermo公司;DL2000 DNA 標準參照物、Taq DNA聚合酶、dNTP、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒購自TaKaRa公司;引物由上海英濰捷基生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 核酸檢測儀(Eppendorf公司);基因擴增儀(Applied Biosystems公司);凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司);高速冷凍離心機(Heraeus公司);恒溫水箱(上海醫(yī)療器械公司);搖床(上海?，攲嶒炘O備有限公司);電穿孔儀(Bio-Rad公司);電泳儀(南京馳順科技有限公司);CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司);倒置生物顯微鏡系統(tǒng)(Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 cag1基因兩側同源臂的擴增 根據基因庫中的H.pylori全基因組序列，設計cag1基因上游和下游同源臂序列F1、F2的引物(表1)，cag1基因全長348 bp，引物P1/P2用于擴增F1，引物P3/P4用于擴增F2。以H.pylori NCTC11637基因組DNA為模板，進行PCR擴增。擴增條件:95℃ 5 min，95℃30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 個循環(huán)，72 ℃10 min;PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后通過凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析鑒定，使用膠回收試劑盒回收產物，－20℃保存。

表1 引物序列Tab 1 Sequence of primers

1.2.2 自殺質粒 pBluescript/Δcag1 ∶∶Kmr的構建

膠回收上下游同源臂片段與pMD-18T載體，通過T4DNA連接酶4℃連接16 h。將連接后的混合物，通過熱擊轉化入 E.coli DH5α，然后涂布于含100 μg/mL氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h。長出陽性菌落后，挑下繼續(xù)接種于含100 μg/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基內，37℃振搖過夜，按照分子克隆指南中堿裂解法抽提細菌質粒，并進行酶切鑒定。膠回收上下游同源臂F1與F2，酶切兩個片段與含卡那霉素抗性(Kmr)片段的pBluescript載體，分步進行連接，連接產物轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，轉化后涂布于含50 μg/mLKmr的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單個菌落接種于含50 μg/mLKmr的LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖過夜后抽提質粒，進行酶切鑒定，構建自殺質粒pBluescript/Δcag 1 ∶∶Kmr。

1.2.3 cag1基因缺陷株的構建 H.pylori NCTC11637在哥倫比亞固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h后，刮取細菌至1 mL 10%蔗糖與甘油的混合溶液，4℃ 5 000 r/min離心10 min(重復3次);沉淀重懸于100 μL 10%蔗糖甘油混合溶液中，4℃或冰上孵育10～15 min;加自殺質粒約25 μg，4℃或冰上再次孵育5～10 min;移入冰預冷的0.2 cm規(guī)格大小的電擊杯，準備點擊轉化。將電擊杯放入電擊儀器上的正確位置，確保正負極連接正確，將儀器工作條件設為25 F，2.5 kV，200 Ω，電擊5 s后，立即將電擊杯中的液體全部均勻涂布于含12.5 μg/mL卡那霉素的哥倫比亞平板上，37℃微需氧培養(yǎng)72 h。

收集培養(yǎng)細菌后進行尿素酶以及細菌革蘭染色鑒定，提取基因組DNA進行PCR鑒定。以上游同源臂F1的上游引物P1和下游同源臂F2的下游引物P4，進行 PCR擴增。反應條件:94℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)，72 ℃10 min，以野生株作為PCR擴增對照。擴增結果送上海英濰捷基生物工程公司測序。鑒定無誤后，證明突變株構建成功，將其命名為Δcag1。

1.2.4 胃上皮 GES-1細胞與 H.pylori野生株及cag1基因缺陷株共培養(yǎng) 胃上皮GES-1細胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)2 d，H.pylori野生株和缺陷株Δcag1按照微需氧方法培養(yǎng)3 d，然后按照MOI=300∶1的比例，于細胞中加入細菌，培養(yǎng)8 h。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

2 結果

2.1 cag1基因兩側同源臂的制備

以H.pylori NCTC11637基因組DNA為模板，引物P1/P2、P3/P4分別用于擴增上游同源臂F1(598 bp)和下游同源臂F2(737 bp)。擴增產物見圖1。

圖1 cag1基因上下游同源臂PCR產物Fig 1 PCR amplification of F1 and F2 fragments of cag1 gene

2.2 cag1基因缺陷自殺質粒的構建與酶切鑒定

自殺質粒 pBluescript/Δcag1∶∶Kmr由上下游同源臂與pBlueKM40載體連接后構建完成，進行酶切鑒定。經KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切后，出現約598 bp片段，即為F1片段;經EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后，出現約737 bp片段，即為F2片段;經KpnⅠ、BamHⅠ酶切后，出現約2 700 bp大小的片段，即為F1、F2、Kmr基因相加片段。符合設計結果。見圖2。

圖2 自殺質粒的酶切鑒定Fig 2 Identification of the suicide vector by restricted enzyme digestion

2.3 cag1基因缺陷株的鑒定

使用野生株、經卡那霉素篩選的陽性細菌為模板，通過cag1基因同源臂F1上游引物P1和F2下游引物P4作PCR鑒定。結果顯示，野生株PCR產物約為1 400 bp，缺陷株PCR產物約為2 700 bp，與設計結果相符。擴增產物測序結果也符合預期結果，證明cag1基因缺陷株構建成功。見圖3。

圖3 H.pylori cag1基因缺陷株的產物鑒定Fig 3 Identification of H.pylori cag1 gene mutant

2.4 H.pylori野生株和cag1基因缺陷株與GES-1細胞共培養(yǎng)后細胞形態(tài)的變化

H.pylori NCTC11637野生株和cag1基因缺陷株分別與GES-1細胞共培養(yǎng)8 h的結果顯示，野生株感染后的細胞幾乎都被破壞，無正常形態(tài)，出現破碎、分散、延長和不規(guī)則變化的現象;而cag1基因缺陷株感染的細胞更接近于未感染細胞，仍存在大量梭形的正 常細胞，較少出現細胞破壞的現象。見圖4。

圖4 GES-1細胞與H.pylori野生株和cag1基因缺陷株共培養(yǎng)后的形態(tài)學觀察Fig 4 Morphological image of GES-1 cells infected with the H.pylori wild-type strain and cag1 gene mutant strain

3 討論

H.pylori是胃部疾病的重要病原體，其全球感染率高達50%，已成為世界重大公共衛(wèi)生問題。國際癌癥研究機構(IARC)將其列為第一類致癌原［4］。近期文獻報道了cag PAI及其編碼的相關毒力蛋白CagA 在 H.pylori感染致病中的重要性［5－6］。流行病學研究證明，cag PAI陽性的H.pylori菌株致病性明顯高于cag PAI陰性株［7］。整個cag PAI區(qū)域長達35 000 ～40 000 bp，包含29 ～31 個基因［8－9］。其編碼蛋白構成一種類似菌毛樣結構的Ⅳ型分泌系統(tǒng)，該結構伸出細菌表面，可將毒力因子注入宿主細胞［10］。該Ⅳ型分泌系統(tǒng)的蛋白中有11個與A.tumefaciens中的經典 VirB/D4系統(tǒng)同源［3］。

目前，關于cag1基因功能的研究甚少。但在H.pylori感染的胃組織標本中，cag1基因表達水平極高。與其相似的高表達基因還有尿素酶基因和過氧化氫酶基因等，上述基因功能與細菌存活和生長密切相關，說明在惡劣環(huán)境下cag1基因可能對維持細菌存活具有重要的作用［11］。生物信息學分析結果顯示，cag1編碼蛋白存在信號肽，在N端第21和22個氨基酸位置有切割位點，并且預測其可能是一種新型的分泌蛋白［12］。

本研究以cag PAI首個編碼基因cag1作為研究對象，利用同源重組原理，構建cag1基因的缺陷株。選用克隆質粒 pBluescript SKⅡ(-)構建自殺質粒，并在載體中插入一個含啟動子的Kmr基因片段，采用PCR方法擴增得到cag1基因兩側片段F1(598 bp)與F2(737 bp)，作為同源臂連接于載體抗性基因片段的上下游，成功構建cag1基因缺陷自殺質粒［13］。采用電擊轉化技術將該質粒轉化入野生株。由于pBluescript SKⅡ(-)在H.pylori中無法復制，但具有自殺性，致細菌染色體與載體發(fā)生同源重組，使Kmr基因置換野生株的cag1基因，通過 Kmr篩選cag1基因敲除的缺陷株 pBluescript/Δcag1∶∶Kmr得以建立，并用 PCR方法鑒定該缺陷株。H.pylori感染宿主細胞后，會誘導細胞形態(tài)發(fā)生變化，導致細胞死亡。這種細胞形態(tài)延長的變化稱為蜂鳥樣改變。為了檢測cag1基因缺失對細菌毒力的影響，在獲得cag1基因缺陷株后，觀察H.pylori野生株和cag1基因缺陷株與GES-1細胞共培養(yǎng)后細胞形態(tài)的變化。結果顯示，野生株感染細胞后8 h，細胞破碎、分散、延長且形態(tài)不規(guī)則;而cag1基因缺陷株感染后，細胞大多形態(tài)正常。以上結果說明，cag1基因缺失后，共培養(yǎng)的GES-1細胞破壞減少。因此，我們認為cag1基因缺失使H.pylori的毒力減弱，但毒力減弱的具體機制尚有待進一步研究。

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