KPC1和胞質p27Kip1在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義

吳愛民，韓云，陳燕，周紅

(南通市第一人民醫院婦產科，江蘇南通226001)

卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于宮頸癌和子宮內膜癌，但死亡率卻超過了后兩者之和，嚴重威脅女性的健康。p27Kip1是細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制蛋白之一，在細胞核中能夠與細胞周期蛋白E-CDK2結合，發揮阻滯細胞周期的作用［1］，作用于包括卵巢癌在內的多種腫瘤細胞［2］。已有研究顯示，胞質中的p27Kip1與卵巢癌的不良預后相關［3］。Kip1泛素-促進復合體 1(Kip1 ubiquitination-promoting complex，KPC1)是一種E3泛素酶復合體亞基之一，能夠降解從胞核轉運至胞質中的 p27Kip1［4］。

本研究擬采用免疫組織化學法檢測卵巢癌組織中KPC1和胞質p27Kip1的表達情況，并分析其表達與患者臨床病理因素之間的關系。

1 材料和方法

1.1 組織標本

收集2008年1月至2011年12月于我院婦產科行手術切除，經病理證實、甲醛固定、石蠟包埋的卵巢癌切片標本64例;患者年齡32～77歲(平均61歲)，術前均未做任何輔助性治療。病理資料如下:高分化14例，中分化31例，低分化19例;漿液性癌36例，黏液性癌14例，子宮內膜樣腺癌8例，透明細胞癌6例;發生轉移40例，未發生轉移24例;有腹腔積液21例，無腹腔積液43例。

1.2 抗體

兔抗人p27Kip1多克隆抗體購自 Santa Cruz公司，鼠抗人KPC1單克隆抗體購自Abcam公司，二抗及DAB顯色試劑盒購自Dako公司。

1.3 免疫組織化學分析

病理組織切片置于60℃烤箱烘烤6～8 h，然后經二甲苯脫蠟、梯度乙醇(濃度由高到低)水化后，高壓鍋檸檬酸鹽(pH=6.0)修復抗原。室溫孵育一抗(KPC1，1 ∶100;p27Kip1，1 ∶500)2 h，洗滌。室溫孵育二抗30 min，DAB顯色液顯色5 min，自來水沖洗終止反應。蘇木素復染細胞核，鹽酸乙醇脫色。梯度乙醇(濃度由低到高)脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組織化學評分

采用Leica正置顯微鏡拍攝。切片陽性表現為細胞核和(或)細胞質出現棕黃色顆粒，陰性對照則無棕黃色反應物出現，僅僅細胞核染成藍紫色。所有切片評價由筆者和兩位未知患者資料的病理專家獨立進行，三者評價綜合考慮作為該切片的染色分級。

KPC1陽性表現為廣泛胞質著色。根據切片的染色深度分為不同的等級:0，無著色;1，輕度著色;2，中度著色;3，重度著色。0和1為低表達，2和3為高表達。計數方法:每張切片選取5個有代表性的高倍鏡視野(400×)，向同一個方向移動切片，不重復，不重疊。

p27Kip1陽性表現為細胞核和(或)細胞質出現棕黃色顆粒。評分按照陰性、核染和質染3種計算。胞質和胞核染色分開評分，不疊加。計數方法:每張切片選取5個有代表性的高倍鏡視野(400×)，向同一個方向移動切片，不重復，不重疊，每個視野隨機計數300個腫瘤細胞，共計算1 500個腫瘤細胞內的陽性細胞百分率。陰性定義為胞質不著色，陽性核＜5%;胞質染色分級同KPC1;當染色出現在胞核而不在胞質時，切片定義為“僅僅核染”。核染色定義 ＞5%為高表達，＜5%為低表達。

1.4 統計學處理

采用SPSS 15.0統計軟件，數據采用 Pearson χ2檢驗，檢驗水準為α=0.05。采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌組織中KPC1和胞質p27Kip1的表達

免疫組織化學結果顯示，KPC1呈胞質定位，低分化組織內可見密集棕黃色顆粒，呈強陽性表達;中分化組織內可見較多棕黃色顆粒，KPC1呈中等陽性表達;高分化組織內可見彌散分布的棕黃色顆粒，KPC1呈弱陽性表達。p27Kip1散在分布于組織切片內，呈胞核和(或)胞質定位，高分化組織中p27Kip1主要是胞核著色，胞質少見著色，而低分化組織中明顯見到胞質著色。從不同組織病理類型來看，p27Kip1和KPC1在漿液性癌、黏液性癌及子宮內膜樣癌中表達明顯，而在透明細胞癌中幾乎無表達。見圖1和圖2。

2.2 KPC1及胞質p27Kip1的表達與臨床病理因素的相關性

如表1所示，KPC1表達與FIGO分期、腫瘤分化程度、病理類型、轉移情況相關(P均＜0.05)，而與年齡、腫瘤殘灶、腹腔積液等無相關性(P均＞0.05)。胞質p27Kip1的表達與患者的FIGO分期、腫瘤分化程度、病理類型相關(P均＜0.05)，而與年齡、轉移情況、腫瘤殘灶、腹腔積液等無相關性(P＞均0.05)。

圖1 KPC1和p27Kip1在不同分化癌組織中的表達(400×)Fig 1 The expressions of KPC1 and p27Kip1in various differentiated neoplasm

圖2 免疫組織化學檢測KPC1和p27Kip1在上皮性卵巢癌組織中的表達(400×)Fig 2 Immunohistochemical analysis of KPC1 and p27Kip1expression in epithelial ovarian cancer

表1 KPC1和胞質p27Kip1的表達與上皮性卵巢癌臨床病理參數間的關系Tab 1 The relationship between the expression of KPC1 and cytoplasmic p27Kip1 and the clinical pathological parameters of epithelial ovarian cancer

2.3 KPC1與胞質p27Kip1的相關性

KPC1和胞質 p27Kip1屬于等級資料，采用Spearman相關分析顯示，KPC1與胞質p27Kip1表達呈正相關(r=0.493，P ＜0.01)。

3 討論

細胞周期紊亂是癌癥進程中的首要事件。p27Kip1作為一種CDK抑制蛋白，能夠阻滯細胞從G1期進入S期［1］，并且其表達丟失與各種腫瘤的進程有密切關系。p27Kip1轉運至胞核外往往失去了周期抑制作用。在卵巢癌中，胞質亞細胞定位的p27Kip1在漿液組織中表達多于黏液組織。多因素生存分析顯示，胞質p27Kip1而不是胞核p27Kip1，是獨立的預后指標［3］。本研究檢測了不同病理標本中p27Kip1的表達，結果顯示，胞質p27Kip1在低分化組織中的表達較高分化組織高，其表達與腫瘤分化程度相關(P＜0.05)，與之前的研究結果一致［5］。

本研究結果表明，KPC1在卵巢癌細胞質中表達，腫瘤分化程度越低其表達深度越強。病理因素分析結果顯示，KPC1與FIGO分期、腫瘤病理類型等因素有關(P均＜0.01)。此外，Spearman相關性分析結果顯示，KPC1與胞質p27Kip1表達呈正相關(r=0.493，P ＜0.01)。上述結果提示，KPC1 與胞質中p27Kip1呈共表達。當細胞處于G1期時，有絲分裂信號刺激p27Kip1Ser10磷酸化，然后借助Jab1/CRM1由核內轉運至胞質［6－7］;進而被一種未確定的E3泛素酶復合物泛素化，經由蛋白酶體降解。而在S期和G2期，胞核中周期蛋白 E-CDK2刺激p27Kip1Thr187磷酸化，SCFskp2使其泛素化，最后由蛋白酶體降解［8］。Kamura 等［4］發現，E3 復合體命名為Kip1泛素-促進復合體，由KPC1和KPC2兩個亞基組成。KPC1是催化亞基，其羧基端環指結構域能夠與胞質 p27Kip1相互作用，促進 p27Kip1泛素化［9］。KPC2發揮銜接蛋白的作用，參與p27Kip1多聚泛素化與26S蛋白酶體的傳遞［10］。機體內 p27Kip1的 mRNA表達在增殖細胞的整個細胞周期是恒定的，基于翻譯后修飾的調節作用，其蛋白水平因所處周期的不同而不同。分化程度越高，胞核內Ser10發生磷酸化的p27Kip1表達越多，致使其出核轉運增加，進而引起胞質中p27Kip1表達增加。胞質中p27Kip1在Tyr74和Tyr78發生磷酸化后重新進入胞核，而KPC1促進胞質p27Kip1泛素化降解，負反饋抑制入核，擾亂了出入核平衡，從而促進了腫瘤細胞異常增殖。

本研究綜合考查了胞質p27Kip1與其降解蛋白KPC1的表達關系。研究結果提示，二者共表達的上皮性卵巢癌組織的分化程度差，病情嚴重。

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