支原體PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

徐 靜，邱文英，方鵬飛，郭建寶，向丕元，胥燕芳

(四川省華派生物制藥有限公司，四川簡陽641400)

支原體介于病毒和細(xì)菌之間，多形性，可通過0.22 μm濾膜。動(dòng)物疫苗常因有支原體污染導(dǎo)致不安全因素，比如雞滑液支原體引起火雞呼吸道疾病，豬肺炎支原體和豬鼻支原體引起豬呼吸道疾病，因此支原體檢測是獸用疫苗必檢項(xiàng)目。疫苗支原體污染的主要來源是培養(yǎng)疫苗用的培養(yǎng)介質(zhì)[1-2]，細(xì)胞是增殖病毒的主要介質(zhì)，血清是細(xì)胞培養(yǎng)的主要成分[3]，必須采取特別的控制措施防止原輔材料造成疫苗支原體污染。預(yù)防和控制細(xì)胞、血清等被支原體污染必須有良好的檢測方法。目前支原體檢測方法有熒光染色法、培養(yǎng)法、核酸擴(kuò)增法。培養(yǎng)法是支原體檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)，至少需要29 d;并且不是所有支原體都能在同一培養(yǎng)基中生長。商品PCR試劑較為昂貴，對于大批量樣品檢測成本太高。在動(dòng)物疫苗生產(chǎn)中需要快速檢測批量的原輔材料、細(xì)胞、半成品，因此有必要建立一種快捷、簡便、經(jīng)濟(jì)的方法檢測血清、疫苗、細(xì)胞中的支原體，PCR方法是其方法之一[4-6]。商品PCR試劑較為昂貴，對于大批量樣品檢測成本太高。因此建立該P(yáng)CR用于檢測動(dòng)物疫苗相關(guān)產(chǎn)品的支原體污染，保證動(dòng)物疫苗的純凈性。

1 材料

1.1 陽性對照、細(xì)胞、菌種及被檢樣品 豬肺炎支原體MY-99，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)熊焰教授饋贈(zèng)，豬鼻支原體(NCTC10130，BTS-7)、雞滑液支原體(WVU 1853)和口腔支原體(CH19299，ATCC23714)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;陰性對照:水。細(xì)胞:Vero、ST(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)、Marc-145(中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心)、BHK-21(由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng))、PK15-ZJU(浙江大學(xué)饋贈(zèng))、MDBK(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、SP2/0(由中國農(nóng)科院饋贈(zèng))。細(xì)菌:大腸桿菌(C83549)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;巴氏桿菌(C51-17)、副豬嗜血桿菌(HU-SP1)由四川省華派生物制藥有限公司分離保存。檢測樣品:毒種:PCV2(ZJ/C，浙江大學(xué)饋贈(zèng));PPV SC1株和 PRV SE株(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng))，Barhta-k61(哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng))，PRRSV(CH-1R由哈爾濱獸醫(yī)研究所和JXA1-R由中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心饋贈(zèng));疫苗:豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)、偽狂犬病活疫苗(Bartha-k61)、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(CH-1R，由四川華派生物制藥有限公司生產(chǎn)和購自某公司)、雞新城疫活疫苗(Ⅳ系，購自某公司)、鴨瘟活疫苗(購自某公司);血清:新生小牛血清(草原綠野、內(nèi)蒙金源康、杭州四季青、山東勁牛)。

1.2 主要試劑 酚、氯仿和Mastermixture等購自成都博瑞克生物科技有限公司;支原體PCR檢測試劑盒購自北京天之泰生物科技有限公司;支原體固體培養(yǎng)基、支原體液體培養(yǎng)基、改良Frey氏培養(yǎng)基購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要設(shè)備 PCR儀器(BIO-RAD S1000)購自成都百樂，凝膠成像分析儀(WD-9413B)及電泳儀(DYY-6C)購自北京六一儀器廠，臺式冷凍離心機(jī)(TGL-16S)購自成都蜀科儀器有限公司。

2 方法

2.1 支原體引物 參照J(rèn).Timenetsky等[5-7]的報(bào)道進(jìn)行設(shè)計(jì)。將設(shè)計(jì)的引物輸入Genebank進(jìn)行比對。設(shè)計(jì)上游引物 P116 RNA 5’GGCAGCAAACTCGATAGATACCCA 3’，下游引物 P216 RNA 5’TGGACGATCTGTCACTCTGTTAACCTG3’，上下游引物由英濰捷基公司合成。

2.2 PCR方法

2.2.1 DNA模板提取 采用酚氯仿抽提法[8]。

2.2.2 PCR PCR循環(huán):94℃ 4 min，(94℃ 30 sec;55℃ 30 sec;72℃ 30 sec;35個(gè)循環(huán))，72℃10 min。點(diǎn)樣電泳90 V，40 min電泳，紫外線下觀察目的片段應(yīng)為255～275 bp。

2.2.3 敏感性測定 將107.0CCU/mL豬肺炎支原體菌液和105.0CCU/mL雞滑液支原體菌液分別進(jìn)行 10 倍系列稀釋，分別取 10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10和 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度的菌液，采用2.2.1項(xiàng)抽提DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測。

2.2.4 特異性測定 將豬肺炎支原體、豬鼻支原體、雞滑液支原體、口腔支原體、大腸桿菌、兔巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌液采用酚氯仿方法抽提，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測。

2.2.5 與支原體PCR商品檢測試劑盒對比試驗(yàn)

將Vero、ST、Marc-145、BHK-21、PK15、MDBK、SP2/0細(xì)胞、豬肺炎支原體、豬鼻支原體、雞滑液支原體、口腔支原體、豬細(xì)小病毒種毒、豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)、雞新城疫活疫苗(Ⅳ系)、新生牛血清、大腸桿菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌液體采用酚氯仿抽提DNA，然后用兩種PCR方法進(jìn)行同時(shí)檢測。

2.3 與培養(yǎng)法[9]對比試驗(yàn) 支原體培養(yǎng)按《中華人民國和國獸藥典》二○一○年版附錄進(jìn)行。選豬肺炎支原體、雞滑液支原體、口腔支原體、BHK-21細(xì)胞、豬細(xì)小病毒種毒、購自某公司的豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗(CH-1R)、購自某公司的雞新城疫活疫苗(Ⅳ系)，采用支原體培養(yǎng)法和自建的PCR進(jìn)行比較。

2.4 應(yīng)用檢測

2.4.1 細(xì)胞 ST細(xì)胞、VERO細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和PK15:將上述培養(yǎng)72～96 h長至單層的細(xì)胞反復(fù)凍融3次作為樣品，按2.2項(xiàng)方法進(jìn)行檢測。

2.4.2 毒種 濕毒直接取液體抽提DNA模板，凍干毒用無菌MEM稀釋作為樣品，按2.2項(xiàng)方法進(jìn)行檢測。

2.4.3 疫苗 將凍干苗用PBS稀釋成10頭份(羽份)/mL作為樣品，按2.2項(xiàng)方法進(jìn)行檢測。

2.4.4 血清 取血清進(jìn)行5倍稀釋作為樣品，按2.2項(xiàng)方法進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果

3.1 PCR方法檢測結(jié)果 該方法擴(kuò)增出豬肺炎支原體、豬鼻支原體、雞滑液支原體和口腔支原體特異性260 bp左右條帶，(支原體菌株不同，其目的條帶不同，在255～275 bp之間)，陰性對照沒擴(kuò)增出特異性條帶(圖1)。

圖1 PCR方法檢測陽性及陰性對照

3.2 敏感性測定結(jié)果 豬肺炎支原體稀釋到10-9可檢測到明顯的條帶(圖2)。雞滑液支原體稀釋到10-7可見明顯條帶(圖3)。

圖2 用豬肺炎支原體檢測PCR方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 用雞滑液支原體檢測PCR方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3.3 特異性結(jié)果 檢測結(jié)果表明豬肺炎支原體、豬鼻支原體、雞滑液支原體和口腔支原體可見特異性條帶，而大腸桿菌、兔巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌無特異性條帶(圖4)。

圖4 PCR方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 與商品支原體PCR試劑盒對比試驗(yàn)結(jié)果兩種PCR方法檢測BHK-21、豬肺炎支原體、豬鼻支原體、雞滑液支原體、口腔支原體和保存的豬細(xì)小病毒種毒都為陽性，其它細(xì)胞、疫苗、血清和細(xì)菌都為陰性。

3.5 與培養(yǎng)法的對比結(jié)果 支原體培養(yǎng)基能培養(yǎng)出BHK-21細(xì)胞懸液和某公司生產(chǎn)的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的支原體、豬鼻支原體、豬肺炎支原體、口腔支原體，但不能培養(yǎng)出雞滑液支原體和豬細(xì)小病毒種毒懸液中的支原體。用改良Frey氏培養(yǎng)基能培養(yǎng)出雞滑液支原體，但不能培養(yǎng)出豬鼻支原體、豬肺炎支原體和口腔支原體。PCR和培養(yǎng)法檢測雞新城疫活疫苗都為陰性(表1)。

3.6 應(yīng)用檢測結(jié)果 應(yīng)用該P(yáng)CR進(jìn)行檢測，結(jié)果表明 BHK-21、Vero、PK15受支原體污染、PPV、PCV2、PRV種毒受支原體污染、購自某公司的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗受支原體污染。其他細(xì)胞及疫苗未受支原體污染。應(yīng)用檢測結(jié)果見表2。

表1 培養(yǎng)法與PCR方法的對比檢測結(jié)果

表2 PCR方法應(yīng)用檢測結(jié)果

4 討論

支原體檢測方法有熒光染色法、培養(yǎng)法、核酸擴(kuò)增法。PCR方法是一種快速、敏感、特異的方法。將設(shè)計(jì)的引物輸入Genbank進(jìn)行比對，該引物序列對支原體屬的所有支原體都具有特異性，擴(kuò)增出的片段在255～275 bp之間，從而能檢出豬肺炎支原體、豬鼻支原體、雞滑液支原體和口腔支原體的結(jié)果印證Genbank比對結(jié)果。將檢測BHK-21污染的支原體片段測序，表明該細(xì)胞系污染了豬鼻支原體，片段大小為271 bp，與預(yù)期分析結(jié)果符合。敏感性試驗(yàn)表明該方法能檢測出0.01CCU的豬肺炎支原體和雞滑液支原體。與現(xiàn)有商品PCR檢測試劑盒對比，兩種方法符合率達(dá)100%。但該方法比商品PCR試劑盒更為經(jīng)濟(jì)。支原體培養(yǎng)法既是傳統(tǒng)又是是動(dòng)物疫苗產(chǎn)品支原體檢驗(yàn)的參考方法。該方法比較敏感，但相對耗時(shí)。同時(shí)一種支原體培養(yǎng)基并不能培養(yǎng)出支原體屬的所有種。比如用支原體培養(yǎng)基不能培養(yǎng)出雞滑液支原體，但用改良Frey氏培養(yǎng)基可培養(yǎng)出;但改良Frey氏培養(yǎng)基不能培養(yǎng)出豬肺炎支原體、口腔支原體和豬鼻支原體。另外，支原體培養(yǎng)需要液體和固體兩種培養(yǎng)基。需要特殊的營養(yǎng)成分才能培養(yǎng)出，比如常規(guī)的支原體培養(yǎng)基中含醋酸鉈。PCR方法是一種快速的檢測方法，從樣品到獲得檢測結(jié)果僅需3～4 h左右，因此采用PCR非常適合用于評價(jià)原輔材料、半成品和成品中污染的支原體。與培養(yǎng)基培養(yǎng)方法相比，PCR檢測率高14.3%(PCR 7/7陽性，培養(yǎng)方法6/7陽性)。據(jù) Spaepen和 Hopert等報(bào)道[10-11]PCR 與培養(yǎng)基培養(yǎng)法符合率為100%或高于90%。這主要是因?yàn)閱我坏闹гw培養(yǎng)基培養(yǎng)方法并不適于所有支原體生長。運(yùn)用該P(yáng)CR檢測樣品的結(jié)果表明:來自科研院所的細(xì)胞、毒種被支原體污染相對嚴(yán)重。我們的檢測結(jié)果表明有(50%)(6/12)細(xì)胞被支原體污染，這與報(bào)道的60%的細(xì)胞被支原體污染較低，主要是由于一些細(xì)胞株來自生產(chǎn)動(dòng)物疫苗監(jiān)管部門，這些部門在控制支原體方面更為嚴(yán)格、規(guī)范。

建立的PCR方法比培養(yǎng)法是更為快速、敏感、特異、經(jīng)濟(jì)的支原體檢測方法，建議在疫苗生產(chǎn)過程中采用PCR方法檢測細(xì)胞、血清、半成品和成品。

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