Wortmannin對糖尿病腎病大鼠腎組織TNF－α與VEGF表達的影響

關瑩瑩，曹東華

（中國人民解放軍第二○二醫院 檢驗科，遼寧 沈陽110003）

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K）／絲氨酸一蘇氨酸激酶 （v－akt murine thymoma viral oncogene homolog，Akt）通路是真核細胞關鍵的信號轉導通路，在細胞凋亡、代謝、增殖及分化等生命活動中發揮著重要功能，近年來發現PI3K／Akt信號通路與糖尿病腎病（DN）的發生發展關系密切。研究發現，糖尿病腎病大鼠模型的腎皮質中PI3K及Akt活性升高[1]，大鼠糖尿病發病4周后整個腎臟的磷酸化PKB／Akt水平增加，并且體內由Gas6腎臟因子介導的腎小球肥大與PI3K／Akt信號通路有關[2]，雷帕霉素可以緩解大鼠的DN，也能減低腎小球內活化的mTOR及Akt的升高[3]。但是PI3K／Akt信號通路在DN發病機制中具體是如何發揮作用的尚不清楚。本研究利用Western blot方法和RT－PCR方法，檢測DN大鼠在注射PI3K抑制劑Wortmannin后腎組織TNF－α與VEGF表達的變化，為進一步闡明PI3K／Akt信號通路在DN發病中的作用機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

羊抗大鼠TNF－α與VEGF多克隆抗體（Santa－Cruz）；PI3K阻斷劑（Wortmannin）購自Santa Cruz公司，STZ購自美國Sigma公司。

1.2 動物模型的建立及分組

成年健康清潔級SD大鼠40只，雄性，體重200－225g，由中國醫科大學實驗動物部提供。其中30只大鼠用于復制DN模型，10只大鼠作為假手術組。參照Anderson等[4]的方法復制DN模型，10%水合氯醛麻醉（0.3ml／100g），常規備皮消毒，腹部切口，暴露右腎，切除，滴加慶大霉素預防感染。假手術組僅暴露右側腎臟，并不進行切除手術。2W后，腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），50 mg／kg，假手術組大鼠腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液。實驗期間動物自由進食、飲水，不使用胰島素及其他降糖藥物。48h后尾尖取血，測定血糖，血糖≥16.7mmol／L為造模成功。選取20只模型成功的大鼠，隨機分為模型組與Wortmannin處理組。糖尿病模型建立次日起，Wortmannin處理組靜脈注射 Wortmannin（0.5mg／kg），1次／周，共8W，實驗期間動物自由進食、飲水，不使用胰島索及其他降糖藥物，模型組與假手術組注射等量生理鹽水。

1.3 Western blot方法檢測腎組織TNF－α與VEGF的表達

第8周最后1次給藥后，禁食8h，麻醉處死，冰上取左腎皮質，超聲粉碎，離心取上清，Bradford法測定蛋白濃度，加入樣品緩沖液，沸水浴中加熱5 min使蛋白質變性，12%分離膠，4%濃縮膠，電泳，轉印，4℃過夜。一抗 TNF－α、VEGF 與β－actin （1∶200）室溫孵育2h，洗膜，IgG－HRP（1∶5000）室溫孵育2h，ECL發光，凝膠成像分析系統上攝像分析，測目標帶的平均光密度（MOD）。

1.4 RT－PCR法檢測腎組織TNF－α mRNA 與VEGFmRNA的表達

麻醉處死大鼠，冰上取左腎皮質，標本量80－100mg，按RNAout說明書進行總mRNA提取，然后以逆轉錄（RT法）先合成cDNA，再進行PCR擴增；TNF－α：上 游 為 5′－CGAGTGACAAGCCCGTAGCC－3′； 下 游 為 5′－GGATGAACACGCCAGTCGCC－3′，擴增產物全長255bp。VEGF：上游為5′－ACTGGACCCTGGCTTTACTGC－3′；下游為5′－TTGGTGAGGTTTGATCCGCATG－3′，擴增產物全長310bp；β－－actin：上游為5′－GAGACCTTCAACACCCAGCC－3′；下游為：5′－GCGGGGCATCGGAACCGCTCA－3′，擴增產物全長374bp。擴增產物進行1.5%瓊脂糖電泳，UVP凝膠顯像儀掃描并進行圖像分析。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 Western blot結果

Western blot結果顯示，模型組與Wortmannin處理組腎組織TNF－α與VEGF蛋白的表達量均顯著高于假手術組（P＜0.05），而與模型組相比，Wortmannin處理組腎組織TNF－α與VEGF蛋白的表達量明顯降低（P＜0.05）。見圖1，圖2。

圖1 Western blot方法檢測各組小鼠TNF－α和VEGF蛋白的表達

圖2 各組小鼠TNF－α和VEGF蛋白的光密度值比較

2.2 RT－PCR 結果

RT－PCR結果顯示，與假手術組比較，模型組與Wortmannin處理組腎組織TNF－αmRNA與VEGFmRNA的表達量均顯著升高（P＜0.05），而 Wortmannin處理組腎組織TNF－αmRNA與VEGFmRNA的表達則明顯低于模型組（P＜0.05）。見圖3，圖4。

圖3 RT－PCR方法檢測各組小鼠TNF－αmRNA和VEGFmRNA的表達

圖4 各組小鼠TNF－αmRNA和VEGFmRNA的光密度值比較

3 討論

糖尿病腎病（DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）代謝異常引起的‘腎小球硬化癥”，是DM常見的嚴重慢性微血管并發癥，最終發展為腎衰竭。DN引發的終末期腎功能衰竭（ESRD）正在成為威脅糖尿病患者生命的主要原因。現代醫學在控制血糖、血壓等基礎治療方面取得了很大的進展，但在腎病治療方面尚無特殊進展。DN的基本病理特征早期表現為腎小球高濾過、腎小球肥大，晚期表現為腎小球系膜區細胞外基質（ECM）增生、腎小管間質纖維化，最終導致腎小球硬化、腎功能衰竭。PI3K／Akt信號轉導通路在細胞凋亡、代謝、增殖及分化等生命活動中發揮著重要功能，研究發現，燈盞花素可增加糖尿病大鼠腎臟AktmRNA的表達，進而增加抗凋亡基因bcl－2的表達，影響NF－κB的表達，抑制糖尿病大鼠腎臟肥大，發揮保護腎功能[5]，二黃糖腎康也通過激活PI3K／Akt信號通路有效降低腎臟細胞凋亡[6]，但是PI3K／Akt信號通路在DN發病機制中具體是如何發揮作用的尚不清楚。

腫瘤壞死因子－α（TNF－α）是一種具有廣泛生物學活性的細胞因子，一般情況下適量TNF－α可參與機體免疫反應，具有抗感染、抗病毒和抗腫瘤等作用[7]。TNF－α也可通過多種機制作用于中樞神經系統，調節神經－內分泌功能、介質釋放、抗原遞呈等過程[8]，TNF－α刺激腎小球系膜細胞產生氧自由基，從而使過氧化脂質代謝產物增多，造成細胞內膜損傷，同時能刺激膠原的產生和成纖維細胞的增殖，加上糖基化膠原在血管壁的沉積，促使血管結構改變，最終導致DN等微血管病變[9]，雷帕霉素抑制糖尿病腎病大鼠的腎細胞凋亡可能是通過下調TNF－α、NF－κB的表達來實現的[10]。但是在 DN 發病機制中，PI3K／Akt信號通路能夠通過調節TNF－α表達參與DN的調控尚未見文獻報道。本研究結果發現，DN大鼠經靜脈注射Wortmannin處理后，腎組織內TNF－α蛋白和mRNA的表達均顯著降低，結果提示 Wortmannin抑制PI3K／Akt信號通路后，TNF－α的表達也受到了抑制，說明在DN發病機制中，調節TNF－α的表達可能是PI3K／Akt信號通路參與DN調控的機制之一。

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是體內一種強效促血管生成因子，能直接作用于血管內皮細胞，促進血管內皮細胞的增殖，直接或間接參與血管生成，增強血管通透性，缺血或缺氧是誘導VEGF上調的重要因素[11]，它主要通過與其酪氨酸激酶受體 VEGFR－l和VEGFR－2結合發揮作用，在炎癥、創傷愈合、心臟缺血、動脈粥樣硬化、糖尿病性視網膜病變等諸多與血管生成和組織愈合及再生、腫瘤形成等病理過程中發揮重要作用。研究發現，VEGF可促進糖尿病小鼠腎小球新生血管生成，其表達上調與糖尿病腎臟病變密切相關[12－14]。但是在 DN 發病機制中，PI3K／Akt信號通路能夠通過調節VEGF表達參與DN的調控尚未見文獻報道。本研究結果發現，DN大鼠經靜脈注射 Wortmannin處理后，腎組織內VEGF蛋白和mRNA的表達均顯著降低，結果提示上調VEGF的表達可能是PI3K／Akt信號通路參與DN調控的機制之一。

本實驗結果的發現有利于PI3K／Akt信號通路參與DN調控的機制，能夠為DN的藥物治療提供一定參考依據。

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