CD8＋T淋巴細胞在動脈粥樣硬化斑塊中作用的研究

馮 靜，孟曉萍

（1.北京市門頭溝區醫院 心內科，北京102300；2.吉林大學第二臨床醫學院 心內科，吉林 長春130033）

1 材料與方法

1.1 主要試劑與所需實驗材料的配制

鼠抗人CD8抗體購于北京博奧森生物技術有限公司。SP－9710試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司。高脂飲食配制：按照重量比：10%豬油，1%膽固醇，5%蛋黃粉，0.1%脫氧膽酸，84%基礎飼料。

1.2 試驗動物及模型建立

實驗動物購買自北京維通利華實驗動物公司，共28只，8周齡，雌雄不限。其中16只為Apoe基因敲除 （Apoe－／－）小鼠，平均體重22g，隨機分為高脂飲食組（以后簡寫為Ah）10只，正常飲食組（An）6只；另12只為與基因敲除小鼠同源的C57BL／6小鼠，平均體重17g，隨機分為高脂飲食組（Ch）6只，正常飲食對照組（Cn）6只。Ah組及Ch組小鼠給予高脂飲食，An組及Cn組給予正常飲食，喂養12周。

1.3 標本制備

造模12周后，脫頸處死小鼠，快速分離主動脈（由主動脈弓至髂動脈分叉），留取主動脈弓，置于4%多聚甲醛中固定約48小時，進行脫水、透明、浸蠟、包埋等操作，獲得石蠟包埋標本。

1.4 HE染色

將小鼠主動脈弓部石蠟包埋標本切片組織立即泡于10%福爾馬林固定液中固定24h，予以常規石蠟包埋、切片，制成4μm切片；行HE染色。

染色結果：胞核呈藍色，胞漿呈紅色，紅細胞呈桔紅色，其他成分呈深淺不同紅色，在光學顯微鏡下進行血管形態學觀察及拍照。

1.5 免疫組織化學染色及圖像分析

1.5.1 取得臨床標本組織立即泡于10%福爾馬林固定液中固定24h，予以常規石蠟包埋、切片；再將切片貼附于涂有多聚賴氨酸的玻片上備用，待行免疫組化染色。CD8抗體檢測采用免疫組化S－P法（鏈霉素抗生物素蛋白一過氧化物酶），按試劑盒說明書進行。

1.5.2 圖像分析 在光學顯微鏡下，細胞漿中出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。采用單盲法閱片，每張切片隨機取4個視野，應用計算機圖像分析，采用Motic Images Advanced3.2圖像分析儀測灰度值（灰度值越大陽性越弱）測定抗CD8免疫沉淀物灰度值對染色程度作相對定量分析。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 小鼠主動脈斑塊活體觀察結果

Ah組小鼠有動脈粥樣硬化斑塊形成，斑塊主要集中在動脈分叉處，斑塊數量中等，腹主動脈某些小鼠可見斑塊。An組小鼠無動脈粥樣硬化斑塊形成。Ch組小鼠未見動脈斑塊形成，但腹腔及各組織臟器表面脂肪含量明顯增多。對照組（Cn）小鼠無動脈斑塊形成。

2.2 小鼠主動脈HE染色結果

Ah組小鼠HE表現為內膜凸向于官腔形成大的斑塊，內彈性膜被破壞，并可見大量泡沫細胞。Ch組小鼠HE染色可見小的斑塊，內彈性膜粉染部分被破壞。An組及Cn組小鼠HE均表現為正常的血管結構，4組小鼠外膜皆為結締組織。

圖2 An組HE染色

圖3 Ch組HE染色

圖4 Cn組HE染色

圖1－4均為鏡下100倍成像：①Ah組小鼠HE表現為內膜凸向于官腔形成大的斑塊，內彈性膜被破壞，內膜可見大量泡沫細胞，中膜被破壞有大量的膽固醇結晶。②An組小鼠HE表現為正常的血管結構，內膜光滑內皮細胞胞核略凸向于官腔，內彈性膜粉染清晰可見；中膜由幾層平滑肌細胞組成。③Ch組小鼠HE表現為內膜略凸向于官腔，可見小的斑塊，內彈性膜粉染部分被破壞；中膜由幾層平滑肌細胞組成，斑塊處平滑肌細胞排列紊亂。④Cn組小鼠HE表現為正常的血管結構，內膜光滑內皮細胞胞核略凸向于官腔，內彈性膜粉染清晰可見；中膜由幾層平滑肌細胞組成，平滑肌細胞核為長桿狀。

2.3 抗CD8免疫組化染色結果

Ah組小鼠表達很少量的黃褐色顆粒，該顆粒表示為被辣根過氧化酶標記的CD8；An組可見較多的黃褐色顆粒；Ch組，表達少量的黃褐色顆粒；Cn組黃褐色顆粒表達較多，呈強陽性；見圖5～8（均為鏡下200倍成像）。

圖5 Ah組抗CD8免疫組化染色

圖6 An組抗CD8免疫組化染色

圖7 Ch組抗CD8免疫組化染色

圖8 Cn組抗CD8免疫組化染色

2.4 抗CD8灰度值比較

An組，Ch，組Ah組各自抗CD8灰度值較Cn組均升高，且P＜0.01；組間CD8灰度值比Ah＞Ch＞An＞Cn，即表達CD8水平為Ah＜Ch＜An＜Cn，見表1。

表1 CD8免疫沉淀物灰度值分析（±s）

表1 CD8免疫沉淀物灰度值分析（±s）

與對照組（Cn）比較＊＊P＜0.01，有統計學意義.

組別 n CD8 P值0.01 Cn 6 71.3±1.212 An 6 103.83±5.193＊＊ ＜0.01 Ch 6 125.0±2.608＊＊ ＜0.01 Ah 10 134.7±2.497＊＊ ＜

3 討論

近年來，免疫機制在動脈粥樣硬化（atherosclerotic，AS）形成中的作用備受觀注，多種細胞及細胞因子相互作用、影響，共同形成AS的免疫機制，促成了AS的發生和發展。有研究表明[1，2]，在AS斑塊的進展過程中，T淋巴細胞在AS斑塊內占所有有核細胞總數的10%－20%，然而T淋巴細胞在AS中究竟扮演何種角色，目前尚無定論。關于CD8＋T淋巴細胞在AS中的作用及其在AS中的表達水平亦有爭論，Hsue等發現[3]耗竭C57BL／6小鼠體內CD4＋和CD8＋T淋巴細胞可以減少脂紋的形成；國內學者研究發現在CHD患者中，CD4＋T淋巴及CD8＋T淋巴兩個亞群細胞的比例都有減少，其中以CD8細胞減低更為顯著，T淋巴細胞功能出現異常[4]。

本實驗結果顯示：在AS過程中，CD8＋T淋巴細胞數量減少。我們認為無論是CD8＋T淋巴細胞減少還是增多都說明在AS過程中伴隨著免疫反應。這種反應可能加重動脈粥樣硬化，尤其是在ApoE基因敲除小鼠，因為高脂喂養可使ApoE基因敲除小鼠迅速形成廣泛且典型的AS斑塊，隨時間進展，斑塊體積逐漸增加，鈣化逐漸加重。我們認為：CD8＋T淋巴細胞可能引起與AS相關的普遍的細胞凋亡[5]和細胞裂解機制，進而促成AS形成。而到目前為止，結合相關文獻報道，其可能的機制是[6－8]：①CD8＋T細胞特異性識別靶細胞表面的抗原肽途徑：MHC分子復合物后，通過顆粒胞吐釋放穿孔素，使靶細胞膜出現大量小孔，因膜內外滲透壓不同，水分則進入胞漿，靶細胞脹裂而死導致細胞裂解，細胞調亡。②粒酶途徑。CD8＋T細胞上的T細胞受體與靶細胞表面呈遞的抗原互相作用，形成聚合體。細胞中的高爾基體開始堆積，含有粒酶（granzymes）的顆粒重新定位于與靶細胞相接觸的區域，并通過胞吐作用（exocytosis）釋放穿孔素（perforin）和粒酶，后者在前者的幫助下進入靶細胞，激活細胞的凋亡（apoptosis）路徑，誘導細胞的死亡。③Fas途徑，某些CD8＋T細胞缺乏穿孔素和粒酶，它們通過Fas途徑來介導細胞毒性，導致細胞的凋亡。另外，CD8＋T細胞活化后能夠分泌出大量的炎癥因子，包括細胞因子、趨化因子等，如白細胞介素、IFN－r、TNF－a、TNF－β等，這些因子可激活巨噬細胞，巨噬細胞再釋放出多種細胞因子，起到免疫級聯擴大的效應，使動脈成纖維細胞的表型發生轉變，促進動脈粥樣硬化的進程。細胞凋亡也可能由巨噬細胞和平滑肌在致炎細胞因子的作用下產生的活性氧和含氮類活性成分引起。

我們的實驗是應用ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化模型，而在ApoE基因敲除小鼠的高脂飲食組動脈粥樣硬化的斑塊部位CD8＋T淋巴細胞表達減少，說明在疾病發生發展過程中除了細胞免疫的參與，還可出能出現錯綜復雜的相互協同、相互影響的抗原抗體反應，促進AS的發生、發展。目前認為可能與AS發病相關的抗原有氧化的低密度脂蛋白（OX－LDL），OX－LDL在 AS的發生發展中起多方面的作用，其一是作為抗原引發AS的免疫反應[9]。AS斑塊部位的CD8＋T細胞可對OX－LDL產生免疫反應。

近年來的研究發現細胞因子、機械損傷、炎性反應、ox－LDL、氧自由基、T淋巴細胞均能調節基質金屬蛋白酶（MMPs）的產生[10]。活化的CD8＋T淋巴細胞可分泌出大量的TNF－a，后者表達的升高，可導致巨噬細胞分泌的膠原酶增多及MMPs量的改變[11]，參與 AS的形成。

目前許多免疫性疾病通過免疫抑制治療都取得了較好的療效，把免疫機制作為AS研究的切入點，進一步研究T淋巴細胞在AS中作用機制，可以為AS的診斷和治療提供新的方向。

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