豬小腸與犬食管脫細(xì)胞基質(zhì)（ECM）構(gòu)建組織工程化人工食管的比較研究

李春霖，薛錦儒，崔建華

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胸外科，吉林 長(zhǎng)春130033）

食道癌是我國(guó)北方人群中的一種高發(fā)疾病，外科手術(shù)是治療該病的首選方法。然而，手術(shù)所造成消化道結(jié)構(gòu)的改變以及對(duì)消化生理的影響是不可逆轉(zhuǎn)的，所以長(zhǎng)久以來(lái)人們一直在尋找一種食管替代物以代替病變食管，人工食管的研究逐漸成為胸外科對(duì)食道病損治療探索的主要課題。盡管用不同的材料和組織進(jìn)行過(guò)許多人工食管的研究［1］，直到組織工程技術(shù)的興起才為人工食管的發(fā)展開辟了廣闊的前景。采用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建人工食管，是人工食管研究的一種新的方法，其中種子細(xì)胞的選擇、支架材料的研制、種子細(xì)胞與支架材料的復(fù)合是整個(gè)研究的關(guān)鍵所在。

我們采用了犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）做為種子細(xì)胞，豬小腸脫細(xì)胞基質(zhì)膜（IECM）作為載體支架，分別以犬自體食道脫細(xì)胞基質(zhì)（EECM）和人工滌綸材料補(bǔ)片（ePTFE）作為對(duì)照，比較研究BMSCs在上述三種材料上的生長(zhǎng)情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本地白豬，體重35kg左右 ，雌雄不限；本地家犬，雄性，10月齡左右，體重約15 kg。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置均符合動(dòng)物倫理學(xué)的要求。

1.1.2 主要試劑 狗骨髓間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（美國(guó)cyagen公司），重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（美國(guó)peprotech公司），胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司），CD29，CD34，CD44，CD45，CD90，CD105流式抗體（美國(guó)Beckman公司）等。

1.1.3 主要設(shè)備 掃描電子顯微鏡（日本Olympus公司），倒置相差顯微鏡（日本電子公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）等。

1.2 方法與步驟

1.2.1 細(xì)胞外基質(zhì)膜的制備及處理 取新鮮豬小腸若干，選自空腸部分。沿縱軸切開，特制裝置下固定，以眼科剪在肌層剪出一系列稠密切口，切口深度不可超出肌層。用自制刮除器將肌層仔細(xì)刮除，然后將其翻轉(zhuǎn)，以同樣的方法將小腸的粘膜層刮除干凈，所剩下白色菲薄，半透明的膜狀物即為脫細(xì)胞基質(zhì)膜（ECM），如圖－1所示。在刮除過(guò)程中，應(yīng)間斷生理鹽水沖洗，以保持其表面的濕潤(rùn)性。制備好的ECM標(biāo)本再經(jīng)進(jìn)一步化學(xué)方法處理［2］，材料與溶液體積的比例均保持在1∶100。首先在100mmol／L的乙二胺四乙酸（EDTA）和10mmol／L氫氧化鈉的溶液（ph值為11－12）中浸泡16h，用去離子水沖洗干凈后浸泡于含1mmol／L鹽酸和1mmol／L氯化鈉的溶液（ph值為0－1）中6－8h，去離子水沖洗，置于含1mmol／L氯化鈉的PBS溶液中16h，去離子水沖洗，PBS浸泡2h后再次用大量去離子水仔細(xì)沖洗，－80℃凍存，真空干燥機(jī)冷凍干燥后粒子加速器25kGy照射滅菌［3］。ECM標(biāo)本做電鏡掃描觀察。

圖1 脫細(xì)胞處理的豬小腸基質(zhì)膜IECM

1.2.2 MSCs的體外分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增 取10月齡本地家犬一只，體重約為16.5kg，備皮，常規(guī)麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，選好穿刺點(diǎn)，取一次性骨穿包，消毒鋪巾。穿刺成功后取50ml注射器并預(yù)抽2ml肝素鈉以抗凝，抽取骨髓血20ml左右后將穿刺點(diǎn)加壓包扎。迅速于無(wú)菌操作臺(tái)中，將骨髓血轉(zhuǎn)入50 ml離心管，并加入20ml PBS，1 500rad／min，離心8min。棄上清，再次加入30ml PBS，再次離心棄上清后加入6ml培養(yǎng)基，吹打混勻，等量接種于兩個(gè)培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中，隔天換液，待換液兩次后即可于顯微鏡下觀察到幾簇梭形、貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞群，為原代細(xì)胞，記為P0。當(dāng)鏡下觀察幾簇細(xì)胞密度過(guò)大時(shí)，吸出培養(yǎng)基，加入適量的0.25%胰酶后放于培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞重新鋪皿，消化完成后重新加入培養(yǎng)基，適量的FGF－basic，搖晃均勻后標(biāo)記為P1，置于培養(yǎng)箱。隔天換液，待鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，再次消化，并以1∶3傳代。重復(fù)如上操作，反復(fù)傳代擴(kuò)增以備使用。

1.2.3 MSCs生長(zhǎng)曲線的繪制 分別取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的1、3、5代的細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，以1×104／孔的密度接種于6孔板中，單獨(dú)培養(yǎng)，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果以細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 MSCs流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取消化后的P2細(xì)胞，加入PBS，制成細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次后，細(xì)胞懸液調(diào)整為密度106／ml，分裝至7只試管中，6個(gè)分別 加 入 5 μl CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105抗體，避光染色30min，1個(gè)作為空白對(duì)照，PBS洗滌兩次后重懸細(xì)胞，上機(jī)，開始流式細(xì)胞儀測(cè)試。

1.2.5 MSCs與支架材料的復(fù)合 分別取大小為2 cm×2cm的IECM，EECM，ePTFE，分別以EECM和ePTFE作為對(duì)照組，IECM作為實(shí)驗(yàn)組。粒子加速器滅菌處理后分為3組，每組20個(gè)，PBS浸泡24 h后置于6孔板中，將第二代MSCs以密度1×107／ml分別接種于其表面，3h后加入適量培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，每48h更換培養(yǎng)液。15d后取出標(biāo)本做石蠟切片，HE染色觀察。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ECM掃描電鏡觀察結(jié)果 ECM經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理過(guò)的基質(zhì)膜表現(xiàn)出良好的立體三維空間結(jié)構(gòu)，具有均勻的空隙率和孔徑，三維孔隙間呈梭狀結(jié)構(gòu)，并且之間相互連通。細(xì)胞層已經(jīng)完全去除，沒有細(xì)胞以及細(xì)胞碎片成分的殘留；表面彈性蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，顯示出規(guī)則的孔隙結(jié)構(gòu)，而且單根的纖維結(jié)構(gòu)沒有明顯的膨脹或碎裂。如圖2所示，可見清晰的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

圖2 脫細(xì)胞基質(zhì)膜電鏡掃描

2.2 MSCs的形態(tài)學(xué)觀察及增值情況 原代細(xì)胞消化重鋪貼壁后可見皿底細(xì)胞均勻分布呈長(zhǎng)梭形纖維細(xì)胞狀，漂浮著少量為貼壁的細(xì)胞，換液即可除去。加入FGF－basic后貼壁細(xì)胞迅速增值分裂，6－7 d細(xì)胞已鋪滿瓶底，融合至95%，呈旋渦狀排列整齊有序，雜質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)明顯少見，如圖3。

圖3 犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞P2培養(yǎng)存化過(guò)程2d，4d，6d，8d，（×100）

2.3 MSCs的生長(zhǎng)曲線 第1、3、5代細(xì)胞培養(yǎng)1－2 d，細(xì)胞增值較慢，為潛伏期，此后，細(xì)胞生長(zhǎng)分裂速度明顯加快，呈指數(shù)形式增長(zhǎng)，進(jìn)入第8天生長(zhǎng)速度減慢，進(jìn)入平臺(tái)期，如圖4，此時(shí)細(xì)胞幾乎鋪滿皿底。

圖4 犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞第1、3、5代生長(zhǎng)曲線

2.4 MSCs表面抗原檢測(cè) 對(duì)P2細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞抗原CD29、CD44、CD90、CD105［4］，表達(dá)率分別為 95.7%、98.4%、99.0%和100%，幾乎不表達(dá) CD34、CD45，如圖5所示，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中所分離提取培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCs。

2.5 細(xì)胞與材料復(fù)合結(jié)果 BMSCs與各組支架復(fù)合培養(yǎng)15d后觀察。觀察培養(yǎng)基成分，判斷有無(wú)污染，各組結(jié)果分別為：EECM組標(biāo)本污染3個(gè)，IECM組與ePTFE組標(biāo)本各污染1個(gè)，污染原因考慮可能為操作中的失誤。取無(wú)污染的標(biāo)本做HE染色，可見BMSCs與IECM組、EECM 組、ePTFE組復(fù)合結(jié)果分別為17、15、8，復(fù)合率為85%、75%、40%，觀察結(jié)果如圖6所示。以IECM組作為實(shí)驗(yàn)組，EECM組作為對(duì)照組時(shí)，復(fù)合結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；ePTFE組作為對(duì)照組時(shí)，復(fù)合結(jié)果有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明IECM 和EECM 與BMSCs復(fù)合效果相似，而ePTFE與BMSCs復(fù)合效果不如IECM。

圖5 P2代犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞流式表面抗體鑒定

圖6 A：復(fù)合培養(yǎng)后ECM上無(wú)BMSCs生長(zhǎng)B：BMSCs與ECM接種后生長(zhǎng)良好 （20×10）

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)內(nèi)的非造血細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞亞群，為成體干細(xì)胞，可在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞類型［5－7］。具有取材方便，易分離培養(yǎng)，增殖能力強(qiáng)，機(jī)體幾乎沒有移植排斥反應(yīng)的發(fā)生，即使發(fā)生，程度也比較輕微，易于處理［8］，是目前公認(rèn)的組織工程最佳種子細(xì)胞。

具有細(xì)胞相容性是對(duì)組織工程支架材料最基本的要求。本文在總結(jié)以往研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)物理化學(xué)相結(jié)合的方法，制備出脫細(xì)胞基質(zhì)膜。ECM有良好的組織相容性［9］，可為種子細(xì)胞提供遷移、附著、增殖的環(huán)境，還可與宿主結(jié)合，促進(jìn)血管的再生［10］，植入體內(nèi)后還可使周圍組織相鄰組織細(xì)胞沿支架移行和生長(zhǎng)［11］，由于去除了細(xì)胞成分，此種來(lái)自異種動(dòng)物的生物材料沒有抗原性，在宿主體內(nèi)不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)［12］，所以用ECM制備人工食管技術(shù)上是可行的［13］。

本實(shí)驗(yàn)研究為構(gòu)建人工食管，將BMSCs與IECM接種后分別于EECM和ePTFE做對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)BMSCs均可與徹底滅菌的3種材料實(shí)現(xiàn)復(fù)合，但在接種成功率方面天然生物材料ECM要明顯高于人工材料ePTFE，與此同時(shí)雖然部分ePTFE也能夠與種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)成功，但完全不具備收縮功能，體內(nèi)組織再生后其不能被降解吸收，將作為異物長(zhǎng)時(shí)間存在。接種BMSCs培養(yǎng)后的IECM與EECM生物學(xué)性狀相似，能夠?qū)崿F(xiàn)功能和生理的再生［14］，因此優(yōu)于人工材料ePTFE，而且IECM來(lái)源廣泛，成本低廉，人工操作性極大，所以以BMSCs為種子細(xì)胞與IECM支架復(fù)合構(gòu)建組織工程化的人工食管，從理論上可以真正實(shí)現(xiàn)生理意義上的食管再生。

［1］楊林珠.人工食管的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)胸心血管外科臨床雜志.2006，13（3）：188.

［2］Abraham GA，Murray J，Billiar K，et al.Evaluation of the porcine intestinal collagen layer as a biomaterial［J］.J Biomed Mater Res，2000，51：442.

［3］李春霖，薛錦儒，崔建華.豬天然管狀SIS人工食管的制備和不同滅菌方式的比較［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013，17（1）：15.

［4］Honczarenko M，Le Y，Swierkowski M，et al.Human bone marrow stromal cells express a distinct set of biologically functional chemokine receptors［J］.Stem Cells，2006，24（4）：1030.

［5］Minguell JJ，Erices A，Conget P.Mesenchymal stem cells［J］.Exp Biol Med，2001，226（6）：507.

［6］Robert JD，Annemarie BM.Mesenchymal stem cells：Biologyand potential clinical uses［J］.Exp Hemato，2000，28：875.

［7］David JA，F(xiàn)red HG，Irving LW.Can stem cells cross the lineageboundaries？［J］.Nat Med，2001，7：393.

［8］LazarusHM，Haynesworth SE，Gerson SL，et al.Ex vivo expansion and subsequent infusion ofhuman bonemarrowderived stromal progenitor cells（mesenchymal progenitor cells）：Implications for therapeutic use［J］.Bone Marrow Transplant，1995，16（4）：557.

［9］Hodde J，Janis A，Hiles M.Effects of sterilization on an extracel－lular matrix scaffold：part II.Bioactivity and matrix interaction［J］.J Mater Sci Mater Med，2007，18（4）：545.

［10］Hodde JP，Record RD，Liang HA，et al.Vascular endothelial growth factor in porcine－derived extracellular matrix［J］.Endothelium，2001，8（1）：11.

［11］吳金鳳，薛錦儒，崔建華.用豬小腸細(xì)胞外基質(zhì)膜（ECM）修復(fù)家兔缺損胸壁的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（10）：1643.

［12］Kropp BP，Cheng EY.Bioengineering organs using small intesti－nal submucosa scaffolds：in vivo tissue－engineering technology［J］.J Endourol，2000，14（1）：59.

［13］崔建華，郝 冰，孟曉萍等.豬多層細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）人工食管的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13（2）：173.

［14］Recrd RD，Hillegonds D，Simmons C，et al.In vivo degradation of 14C－labeled small intestinal submucosa（SIS）when used for urinary repair［J］.Biomaterials，2001，22（19）：2653.