參麥注射液對阿霉素所致心肌細胞損傷的保護作用

陳 昕，趙 雷，孫 波，韓蘊琪，石 毅，周余來

（暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院1.檢驗科；2.麻醉科，廣東 深圳518020；3.吉林大學藥學院生物工程教研室，吉林 長春130021）

在細胞水平進行心肌損傷保護研究是近年熱點，其最大優點在于排除了體內心臟實驗模型中全身神經體液等的影響，以及心臟不同類型細胞間的相互作 用［1，2］。阿霉素（adriamycin，ADM）屬蒽環類抗腫瘤藥，臨床上用于白血病、淋巴瘤、硬癌等的治療，效果顯著，但長期應用可發生心臟毒性效應，其臨床應用受到限制［3］。本研究考察了阿霉素對原代培養的Wistar大乳鼠心肌細胞的損傷作用，并觀察參麥注射液（SMI）對此損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

出生24h內Wistar大鼠，清潔級，由吉林大學基礎醫學院實驗動物中心提供（動物飼養合格證號：NO：0010281）；新生小牛血清、MEM 培養基由GIBCO公司提供；胰蛋白酶由HYCLONE公司提供；鹽酸阿霉素為浙江海正藥業股份有限公司產品（產品批號：061102）；參麥注射液為河北神威藥業有限公司產品（產品批號：070216）；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒、一氧化氮合成酶（NOS）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒為南京建成生物有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳鼠心肌原代培養 取出生24h內的Wistar大鼠心肌細胞培養于MEM培養液中，加入10%滅活胎牛血清，細胞濃度1×105／ml，每孔200 μl接種至96孔板中，37℃，5%CO2培養箱內培養。24h后觀察細胞，當心肌細胞貼壁后，換液。在培養48h后，可見心肌細胞連接成片，并產生有節律的自主跳動。

1.2.2 實驗分組及造模給藥 細胞培養48h，將培養的細胞分組給藥。空白對照組加MEM培養液培養；損傷模型組加阿霉素濃度為2μg／ml的MEM培養液培養；參麥注射液保護組分設3個濃度梯度，分別為100μl 10μg／ml的參麥注射液保護培養液＋100μl 2μg／ml阿霉素損傷培養液、100μl 20μg／ml的參麥注射液保護培養液＋100μl 2μg／ml阿霉素損傷培養液和100μl 40μg／ml的參麥注射液保護培養液＋100μl 2μg／ml阿霉素損傷培養液。

1.3 指標檢測

1.3.1 細胞形態學觀察

心肌細胞培養24h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態，細胞的生長狀態以及細胞的搏動率。

1.3.2 細胞損傷生化指標測定 在心肌細胞給藥培養48h后，按試劑盒說明書檢測培養液上清LDHI和NOS含量；檢測培養心肌細胞超聲破碎得到細胞混懸液檢測MDA的含量。

1.4 統計學處理

數據用統計學軟件SPSS V13.0進行處理。數據以±s表示，兩組間均數的比較用t檢驗。多組間的比較用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

2 結果

2.1 心肌細胞的形態學觀察

空白對照組心肌細胞生長狀態良好，細胞邊緣清晰，相互連接成片，搏動節律一致，搏動頻率為60－80次／min。損傷模型組細胞形態改變明顯，細胞皺縮，細胞的邊緣不清晰，細胞間的連接被破壞，自主節律跳動變為非同步的節律不齊的跳動，搏動頻率為30－40次／min。藥物保護組心肌細胞未裂解，仍有自主性搏動，但細胞仍有部分損傷。搏動頻率為40－60次／min。

2.2 參麥注射液對阿霉素致心肌損傷的保護作用

各組細胞給藥后培養達48h時，損傷對照組心肌細胞培養基中LDH、NOS和MDA含量明顯增加，與正常組比較差異非常顯著（P＜0.01）；而在參麥注射液3個劑量保護組，LDH和NOS含量較ADM損傷模型組依次降低，且降低呈現劑量依賴性；在參麥注射液保護低劑量組MDA指標改善不明顯，而中、高劑量組與ADM組比較MDA含量明顯改善，見表1。

表1 不同濃度參麥注射液對心肌細胞的影響

3 討論

阿霉素是一種臨床上廣泛應用的抗癌藥物，對乳腺癌、肝癌、白血病、卵巢癌等有較好的療效，是治療實體腫瘤最有效的藥物之一［3］。但在它的藥物代謝過程中會產生大量自由基，對人體各器官（尤其是心臟）產生毒性作用。阿霉素在心肌細胞中通過細胞色素P450和黃素單氧合酶轉化為半醌阿霉素。半醌阿霉素具有毒性，并可與分子氧相互作用，觸發級聯反應，產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS與脂質、蛋白質和其他的細胞成分相互作用，導致線粒體和心肌細胞膜的損傷，使細胞膜脂質過氧化增強、蛋白質的功能受抑制、核酸和染色體被破壞，從而嚴重影響細胞各種功能［4］。本研究應用培養的心肌細胞觀察了ADM對心肌細胞的損傷作用，結果顯示，ADM可使培養的心肌細胞細胞形態改變明顯，細胞的邊緣不清晰，細胞間的連接被破壞，自主節律跳動消失，變為非同步的節律不齊的跳動；ADM損傷組乳酸脫氫酶（LDH）含量、一氧化氮合酶（NOS）含量、丙二醛（MDA）含量明顯高于空白對照組。

在正常情況下，體內存在清除自由基和抑制自由基的酶體系（如SOD、CAT等），使之維持自由基產生和清除的動態平衡，防止自由基損傷［4］。為了減輕阿霉素的毒副作用，尋找有效的心臟保護藥物，對發揮阿霉素的抗癌效果具有重要的意義。有研究表明，參麥注射液能夠降低阿霉素所致心肌損傷，對心肌細胞起到了有效的保護作用［5］。

參麥注射液源自古方“生脈散”，主要成分為人參和麥冬。中醫認為有益氣固脫、養陰生津之功效。臨床及藥理研究顯示其具有強壯抗疲勞、抗放射、促進造血功能、保護心肌抗休克以及增強免疫功能等作用［6］。麥冬含多種抗氧化物質，如皂苷、黃酮、多糖以及銅、鋅等微量元素，均有不同程度清除自由基作用。人參有效成分人參皂苷有明顯的心肌保護作用，它能夠抑制缺血再灌注損傷，減少心肌酶的漏出量。人參甲醇提取物中的麥芽醇、水楊酸、草香酸有明顯的抗脂質過氧化作用。麥芽醇不僅能捕捉自由基，具有抗氧化作用，該化合物可以減少膜蛋白分子中巰基的外露，從而穩定了膜蛋白的結構［5］。

本實驗采用乳鼠心臟細胞體外培養技術并從細胞形態學、乳酸脫氫酶含量、一氧化氮合成酶含量、丙二醛含量等方面觀察了參麥注射液對ADM中毒心肌細胞的保護。體外培養的心肌細胞經阿霉素造成損傷后，其代謝和功能等都受到影響，其中LDH的外漏可作為損傷判斷的重要依據。LDH一直被認為是細胞能量代謝的標志性酶之一。LDH產生于線粒體，心肌細胞培養液之中的LDH是由線粒體膜破裂導致酶外漏而產生的［7］。很多實驗資料說明，阿霉素對心肌的毒性效應來源于氧自由基，線粒體是其心臟毒性的主要部位［8］。與ADM同時給予的不同濃度的參麥注射液不同程度地減少了由于ADM損傷造成的LDH的漏出，改善了中毒心肌細胞的搏動頻率。參麥注射液對ADM中毒的心肌細胞的保護作用與其改善線粒體酶功能有關，加強氧化磷酸化過程，提高所需能量，從而維持了心肌細胞節律性搏動等重要生理功能［9］。本研究表明參麥注射液可保護阿霉素引起的心肌細胞損傷，減少乳酸脫氫酶的漏出和改善心肌細胞的搏動情況，其機制與保護心肌細胞線粒體有關。

一氧化氮合酶（NOS）是另一衡量心肌細胞代謝狀態的重要指標，可由阿霉素誘導產生。有研究發現，一氧化氮合酶（NOS）可使細胞產生NO增加，與阿霉素致心肌細胞產生增加的O2－反應生成過氧亞硝基陰離子（ONOO－）。ONOO－是一種強氧化劑，可迅速分解為高活性的OH－和NO等自由基，參與脂質過氧化。本實驗中，損傷模型組的NOS含量高于空白對照組，說明損傷模型組心肌細胞受阿霉素氧化損傷后被誘導產生較多NOS。而在參麥注射液保護組，該指標明顯較低，表示參麥注射液能夠有效的抑制NOS的誘導產生，從而防止產生高活性的OH－和NO等自由基，抑制脂質過氧化，有效的保護了心肌細胞。

丙二醛（MDA）是脂質過氧化反應的主要的最終產物，可進攻蛋白分子的氨基，導致蛋白質的分子內交聯和分子間交聯，使細胞骨架蛋白結構和功能發生改變。MDA含量的增多，可表明脂質過氧化反應增強，間接反映了自由基產生的多少［10］。本實驗結果顯示，給予ADM后繼續培養24h后，損傷模型組的MDA含量明顯高于空白對照組，說明損傷模型組細胞經脂質過氧化損傷之后產生較多的MDA。參麥注射液保護組的MDA含量下降，與損傷模型組形成顯著的差異，說明參麥注射液可以有效的抑制脂質過氧化反應，從而減少MDA的產生。

在本實驗中將參麥注射液與ADM同時應用于培養的心肌細胞，可明顯減輕ADM引起的損傷、保存細胞活力、維持相對規律的心肌搏動。參麥注射液對ADM引起的心肌細胞損傷有一定的保護作用，其機制與參麥注射液保護心肌細胞線粒體及其酶系統有關。在應用阿霉素等蒽環類藥物抗腫瘤治療的同時，輔以參麥注射液可以有效地控制ADM等引起的心臟毒性，為臨床應用提供參考。

［1］柳 梅，張剛成，姚 藝.乳鼠心肌細胞的體外培養［J］.臨床和實驗醫學雜志，2009，8（1）：3.

［2］何 蕾，張 莉，黃靖香.乳鼠心肌細胞的體外培養及生物學特性研究［J］.解放軍醫學雜志，2007，May.

［3］Tokarska－Schlattner M，Wallimann T，Schlattner U.Alterations in myocardial energy metabolism induced by the anti－cancer drug doxorubicin［J］.Comptes Rendus Biologies，2006，329（9）：657.

［4］Wim－Jan P.van Boven，Win B.Gerrisen，Antoine H.Driessen.Myocardial oxidative stress，and cell injury comparing three different techniques for coronary artery bypass graft［J］.European Journal of Cardio－Thoracic Surgery，2008，34（5）：969.

［5］李 茜，張文杰，馬巧珍，等.參麥注射液治療阿霉素致心臟毒性的心電圖觀察［J］.東南國防醫藥，2008，10（1）：43.

［6］戴 金，毛 威，阮善明，阿霉素心臟毒性的中醫防治［J］.現代中西醫結合雜志，2008，（22）：3485.

［7］Lisa Devillard，David Vandroux，Cindy Tissier，et al.Involvement of microtubules in the tolerance of cardiomyocytes to cold ischemia－reperfusion［J］.Molecular and Cellular Biochemistry，2007，307：149.

［8］Dealtey SM，Aksenov MY，Aksenova MV，et al.Adriamycin－induced changes of creatine kinase activity invivo and in cardiomyocyte culture［J］.Toxicology，1999，134：51.

［9］劉曉健，劉 義，胡長宏，等.參麥注射液對阿霉素所致心肌細胞毒性的影響［J］.中國現代藥物應用，2008，2（7）：11.

［10］Zhong Zhao，Yang yang Zhang，Wen Ge，et al.Effect of ecdysterone on heteroptopic heart transplantation in rats［J］.Journal of Nanjing Medical University，2008，22（5）：299.