Smads mRNA在神經元樣細胞氧糖剝奪中的表達變化

王姣琦，何金婷，李宗樹，胥桂華，莽 靖，徐忠信

（吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033）

研究發現激活素A（ActivinA，ActA）在缺血性腦損傷中發揮著積極的神經保護作用［1，2］。其介導的ActA／Smads信號轉導通路，主要通過Smads級聯反應將胞外信號傳遞入胞內［3］。根據Smads蛋白在信號轉導中的不同作用，可將其分為3類：膜受體激活的Smads（receptor－activated Smads，RSmads），包括Smad1，2，3，5和8；通用Smad（common mediator Smads，Co－Smad），目前發現的僅有Smad 4；抑制性 Smads （inhibitory Smads，ISmads），包括Smad6、7［4］。本研究通過微管相關蛋白（Microtubule－associated protein 2，MAP2）染色驗證鼠神經生長因子（NGF，50ng／ml）誘導分化的PC12細胞的神經元特性［5］。繼而構建神經元樣細胞氧糖剝奪模型（oxygen－glucose deprivation，OGD），體外模擬腦神經細胞缺血性損傷［6］。利用Real Time RT－PCR技術對OGD0，3，6h，Smad2、4、7基因mRNA的表達進行檢測，為進一步明確ActA／Smads通路的神經保護機制提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞購自北京金紫晶生物醫藥技術有限公司。鼠神經生長因子（NGF）購自Sigma公司。兔抗大鼠 MAP2一抗、FITC標記的羊抗兔IgG抗體購自博奧森生物技術有限公司。Smad2、4、7及內參GAPDH基因引物委托上海生工公司合成。UNIQ－10柱式Trizol總RNA提取試劑盒購自生工生物工程技術服務有限公司，Quantscript cDNA第一鏈合成試劑盒、Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PC12細胞培養 PC12細胞常規培養于含10%馬血清和10%胎牛血清的高糖DMEM培養液。培養液2－3天更換一次，細胞接近80%融合時用0.25%胰酶進行消化傳代。

1.2.2 PC12細胞轉化神經元及鑒定 取對數生長期的PC12細胞以2.5－5×104·孔－1接種于預先放有細胞爬片的24孔細胞培養板，培養1－2天，細胞貼壁后加入NGF（終濃度50ng／ml），5天后取出細胞爬片，經0.01MPBS浸洗、0.1%TRiton X－100通透、羊血清封閉后加入 MAP2一抗（1∶500）4℃濕盒中過夜孵育，0.01MPBS浸洗后FITC標記的羊抗兔二抗37℃作用20min，防淬滅封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 神經元樣細胞OGD模型的建立 取生長狀態良好的神經元樣PC12細胞，用無糖DMEM培養液沖洗3次，再用含10%胎牛血清和1.0mmol／L Na2S2O4的無糖DMEM培養液進行培養。培養瓶放入37℃孵箱內的缺氧罐中，計時0、3、6h分別建立OGD0，3和6h組。

1.2.4 Real Time RT－PCR檢測Smads基因 mRNA的表達變化 收集上述3組細胞，Trizol法抽提總RNA，反轉錄制備cDNA。應用Real Time RT－PCR方法檢測Smad2、4、7等基因 mRNA的表達，基因檢測引物如下：Smad2F：5′－TCA GTG CGA TGC TCA AGC ATG TCC－3′，R：5′－AGA CCA AGC AGC AGC ACA CAC CTC－3′，擴增長度413bp；Smad7F：5′－TCC TGC TGT GCA AAG TGT TC－3′，R：5′－AGT AAG GAG GAG GGG GAG AC－3′，擴增長度104bp；Smad4F：5′－TCA CCG GCA GAT GCA GCA GC－3′，R：5′－GGC CCC AGC CCT TCA CGA AG－3′，擴增長度 203bp；GAPDH F：5′－GGT TAC CAG GGC TGC CTT CT－3′，R：5′－ATG GGT TTC CCG TTG ATG AC－3′，擴增長度171bp。反應體系為10μl，含上／下游引物（10nmol／L）各1μl，模板 DNA 2μl（約20 ng），ddH2O 1μl，Real Master Mix 5μl。應 用ABI7500Fast型實時熒光定量PCR儀進行PCR反應，ABI7500Fast程序軟件進行熒光收集和資料分析。設定PCR運行參數為95℃預變性3min，然后95℃變性5s，60℃退火與延伸25s，共40個循環，并設定融解曲線程序。實驗結果應用Relative Quantification（ddCt）Study進行相對表達量（relative quantity，RQ）RQ分析。以GAPDH基因為內對照，計算各基因在各組細胞之間的相對表達水平。檢測實驗均重復3次。

1.3 統計學分析

應用SPSS l0.0統計軟件包，計量資料用±s描述，兩個樣本均數的比較采用獨立樣本t檢驗，多個樣本均數比較采用單因素方差分析法，兩組間比較用Students t－test，檢驗水準為雙側α＝0.05。

2 結果

2.1 MAP2免疫熒光染色

正常PC12細胞為圓形，易聚集成團，呈半懸浮狀態。經NGF誘導分化后，細胞散在分布、呈星形并帶有較長突起。MAP2染色后，藍色激發光下胞體呈現綠色熒光；紫色激發光下可見呈藍色熒光的復染細胞核。說明NGF誘導分化的PC12細胞MAP2強陽性表達。

2.2 Smad2mRNA的表達變化

OGD3h后Smad2基因mRNA的表達較OGD0h組升高17.7%；OGD6h，Smad2mRNA 的表達較OGD0h組下調80.9%，差別均有統計學意義（＊＊P＜0.05，圖1－A）。說明氧糖剝奪可早期激活ActA／Smads通路在神經元樣細胞內的轉錄表達。

2.3 Smad4mRNA的表達變化

OGD處理3h，神經元樣細胞Smad4mRNA的表達與OGD0h組相比明顯升高，超過413.4%；OGD6h組Smad4mRNA的表達與OGD3h相比下調73.0%，但與OGD0h相比，表達提高38.8%，差別均有統計學意義（＊＊P＜0.05，圖1－B）。

2.4 Smad7mRNA的表達變化

經OGD處理3h后Smad7mRNA的表達水平與OGD0h相比明顯升高，超過75.2%，差別有統計學意義（＊＊P＜0.05）。延長 OGD時間至6h，Smad7mRNA的表達較OGD0h組下降57.4%，差別有統計學意義（＊＊P＜0.05，圖1－C）。

圖1 Smad2，4，7基因mRNA表達的相對定量

3 討論

最近的研究發現，轉化生長因子β（Transforming growth factor－beta，TGF－β）超家族的重要成員ActA，在腦組織的缺血缺氧性損傷中發揮著積極的神經保護功能［7］。激活的ActA首先與TGF－βII型受體（TGF－βreceptor II，TβRII）結合，激活TβRII磷酸化激酶的同時形成受體復合物，TGF－βI型受體（TGF－βreceptor I，TβRI）結合該復合物，磷酸化激活后完成對Smad2／3的磷酸化活化，從而實現胞外信號的胞內轉導［8］。作為ActA通路細胞內信號調節的主要蛋白，Smads根據其功能的不同又分為3類，即 R－Smads，Co－Smad和I－Smads。作為TGF－β或ActA的下游受體，Smad2／3通過與TβRI型受體作用而磷酸化激活。磷酸化的Smad2／3與Smads錨著蛋白（Smad anchor for receptor activation，SARA）分離并與Smad4形成 Smad2／4 和Smad3／4復合物，進而轉入細胞核與DNA結合，通過與轉錄因子的相互作用完成對靶基因表達的調控［9］。I－Smads通過促進 TβRI受體降解，或與 RSmads競爭TβRI結合位點，抑制R－Smads磷酸化水平的方式來發揮其對該通路的負反饋調節作用。

本研究通過構建神經元樣細胞氧糖剝奪模型，體外模擬神經細胞缺血性損傷。利用Real Time RT－PCR技術對OGD 0，3或6h，Smad2、4、7基因mRNA的表達變化進行檢測。結果發現，OGD處理3h后神經元樣細胞Smad2基因mRNA的表達與未處理組相比明顯升高，分別超過17.7%。這進一步證明了氧糖剝奪模擬的神經細胞缺血性損傷中，ActA／Smads通路可以在OGD早期即通過提高通路上關鍵基因轉錄水平上的表達來激活。而延長OGD時間至6h，Smad2基因mRNA的表達較未處理組下調80.9%。說明 ActA／Smads通路應對OGD損傷時轉錄水平上的激活僅存在于OGD的早期，隨著OGD時間延長，神經細胞缺血性損傷加重，ActA／Smads通路轉錄水平的表達也下調，甚至低于基礎水平。Smad4mRNA的表達變化也證實了這一推測。OGD3h時，Smad4mRNA表達明顯升高，與OGD0h相比上調413.4%。OGD6h時Smad4mRNA的表達水平較OGD3h組下調73.0%，與OGD0h相比，表達仍提高38.8%。這可能與OGD3h時Smad4mRNA表達過高有關。抑制性Smads，Smad7mRNA在OGD3h時的表達水平較 OGD0h升高75.2%；OGD6h時表達下降57.4%。說明ActA／Smads通路在轉錄水平上激活的同時，也存在著Smad7轉錄水平上負性調節功能的增強，兩者動態調節完成對通路活化程度的調控。Hasan O.等人的研究也發現缺氧性損傷可提高血管內皮細胞內Smads基因轉錄水平上的表達［10］。說明Smads介導的神經保護機制不僅存在于神經元，而且還包括血管內皮細胞。

綜上所述，ActA／Smads通路激活主要發生在神經元樣細胞OGD損傷的早期（OGD3h），Smad2，4基因轉錄水平上的表達上調是該通路活化的重要組成部分。抑制性Smad7轉錄水平上參與該通路的負性調節過程。上述研究提示我們對ActA／Smads通路神經保護機制的研究，可能為神經細胞缺血性損傷后的神經保護提供新思路。

［1］Mukerji SS，Katsman EA，Wilber C，et al.Activin is a neuronal survival factor that is rapidly increased after transient cerebral ischemia and hypoxia in mice［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27（6）：1161.

［2］莽 靖，何金婷，徐忠信，等.大鼠局灶性腦缺血Activin A及其受體ActRⅡA表達變化及意義［J］.中國老年學雜志.2010，30（5）：626.

［3］Schmierer B，Hill CS.TGFbeta－SMAD signal transduction：molecular specificity and functional flexibility［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（12）：970.

［4］Kretzschmar M，MassaguéJ.SMADs：mediators and regulators of TGF－beta signaling［J］.Curr Opin Genet Dev，1998，8（1）：103.

［5］Johnson GV，Jope RS.The role of microtubule－associated protein 2（MAP－2）in neuronal growth，plasticity，and degeneration［J］.J Neurosci Res，1992，33（4）：505.

［6］Mei Chun－li，He Jin－ting，Mang Jing，et al.Nerve growth factor（NGF）combined with oxygen glucose deprivation OGD induces neural ischemia tolerance in PC12cells［J］.African Journal of Biochemistry Research Vol，2011，5（10）：315.

［7］He Jin－Ting，Mang Jing，Mei Chun－Li，et al.Neuroprotective Effects of Exogenous Activin A on Oxygen－Glucose Deprivation in PC12Cells［J］.Molecules，2011，30，17（1）：315.

［8］ShiY，Massague J.Mechanisms of TGF－beta signaling from cell membrane to the nucleus［J］.Cell，2003，113（6）：685.

［9］Qin BY，Lam SS，Correia JJ，et al.Smad3allostery links TGF－beta receptor kinase activation to transcriptional control［J］.Genes Dev，2002，16（15）：1950.

［10］Akman HO，Zhang H，Siddiqui MA，et al.Response to hypoxia involves transforming growth factor－beta2and Smad proteins in human endothelial cells［J］.Blood，2001，98（12）：3324.