FRAT1基因真核表達質粒的構建與鑒定

于慶功，張欣欣，谷 偉，王蘇雅，楊子榮

（大連大學附屬中山醫院 消化內科，遼寧 大連116001）

原癌基因FRAT1（frequently rearranged in advanced T－cell lymphomas 1）最初發現于鑒定轉基因小鼠體內促進淋巴瘤生成的基因［1］，后研究發現FRAT1為腫瘤發生相關 Wnt／β－catenin信號轉導通路的正相關因子［2］。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是指在生物體內源性或外源性雙鏈RNA（double－stranded RNA，dsRNA）引起體內同源基因特異性的沉默。RNAi技術具有較高的選擇性和特異性，因其僅抑制致病基因，對正常等位基因的功能不產生影響。本研究以siRNA介導FRAT1表達沉默，后續觀察siRNA導入后對人結腸癌HR－29細胞內的FRAT1表達的抑制作用，為研究FRAT1對結腸癌增值凋亡侵襲的研究提供了穩定的轉染細胞干擾質粒。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌E.coli Competent Cell JM109、限制性內切酶BamHⅠ／ClaⅠ、Premix Taq（Code No.DRR003A）、引 物 pSINsi－F2／pSINs Ⅰ－RTotal、RNA提取試劑（RNAisoTM Plus）、高保真DNA聚合酶（PrimeSTARTM HS DNA Polymerase）、DNA marker、DNA連接試劑盒（DNA Ligation Kit）等均購自TaKaRa公司；載體質粒pSINsi－hU6、質粒小量抽提試劑盒（Plasmid Mini KitⅠ）和純化試劑盒（E.Z.N.ATMCycle－Pure Kit）購自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 FRAT1基因siRNA的設計與合成根據GeneBank中FRAT1（NC＿000010.10）基因序列，采用RNAdraw分析軟件對FRAT1mRNA序列的二級結構進行預測，并利用Elbashir等推薦的siRNA設計原則，尋找合適的siRNA靶序列。選擇在FRAT1基因的864位選取干擾序列。最后得到CTF181－1 核苷酸序列 CAGTTACGTGCAAAGCTT和陰性對照CTF181－N核苷酸序列TCTTAATCGCGTATAAGGC。根據Genbank中FRAT 1（NC＿000010.10）基因序列，分別設計引物，CTF181－1 上游引物序列為：5′GATCCAGCAGTTACGTGCAAAGCTTCTGTGAAGCCACAGATGGGAAGCTTTGCACGTAACTGC TTTTTTTAT3′，下游引物序列 為：5′CGATAAAAAAAGCAGTTACGTGCAAAGCTTCCCATCTGTGGCTTCACAGAAGCTTTGCACGTA－ACTGCTG3′；CTF181－N 上游引物序列 為：5′GATCCATCTTAATCGCGTATAAGGCCTGTGAAGCCACAGATGGGGCCTTATACGCGATTAAGATTTTTTTAT3′，下游引物序列 為：5′CGATAAAAAAATCTTAATCGCGTATAAGGCCCCATCTGTGGCTTCACAGGCCTTATACGCGATTAAGATG3′（斜體部分分別為BamHI、Cla I的酶切位點）。

1.2.2 FRAT1基因siRNA質粒的構建 首先將合成的原始引物CTF181－1，CTF181－N稀釋成0.010D／μl。使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice TP600進行退火反應體系10μl：sense oligo 1 μl、anyisense oligo 1 μl、STE Buffer（10mMTris pH8.0，50mM NaCl，1mM EDTA 配制）1μl、H2O 7μl于94℃退火5min，緩慢降至30℃冷卻90min。陽性和陰性對照的上下游引物自身分別合成含有折環的雙鏈DNA。產物放于4℃冰箱保存。使用TaKaRa DNA Ligation Kit（Code No.D6022）中的Solution I將退火產物分別與pSINsi－hU6（BamH I／Cla I）載體連接后，熱轉化至E.coliCompetent Cell JM109（Code No.D9052）中，分別命名為 CTF181－1、CTF181－N，涂布平板后，37℃過夜培養。

1.2.3 FRAT1基因siRNA質粒的鑒定：從轉化平板上挑取8個單菌落，用Premix Taq（Code No.DRR003A）和引物pSINsi－F2／pSINsi－R進行PCR擴 增，引物序列分別為：pSINsi－F2：CAAGGTCGGGCAGGAAGAGG；pSINsi－R ：CTTTCCACACCTGGTTGCTG，檢測陽性克隆，將反應產物做1%瓊脂糖凝膠電泳。挑取陽性菌落植菌，提取質粒分別命名為 CTF181－1－1、CTF181－N－1，此兩種質粒與空質粒分別穿刺菌保200ng，和未菌保小量克隆質粒加小量原質粒，共分6組，分別為：①CTF182（CTF181－1－1）（200ng）；②CTF181－1－1小量質 粒；③CTF182（CTF181－N－1）（200ng）；④CTF181－N－1小量質粒；⑤CTF182（pSINsi－hu6）（200ng）；⑥pSINsi－hu6原質粒，再次進行 PCR擴增檢測目的基因表達。質粒測序：以質粒抽提試劑盒小量提取擴增后的重組質粒提交大連寶生物公司使用 pSINsi－F2引物對 CTF181－1－1、CTF181－N－1質粒進行測序。

2 結果

2.1 陽性克隆篩選結果 兩干擾序列各挑取8個陽性克隆菌落PCR擴增抽提質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳照片如（圖1），陽性克隆片段分子量應為317 bp，結果顯示CTF－1－1的8個陽性克隆目的基因長度與理論長度相符，表明序列插入質粒。

圖1 兩序列8組陽性克隆菌落PCR凝膠電泳圖片

2.2 PCR擴增檢測陽性菌落結果

提取純化的質粒分6組，結果用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2），目的基因片段長度符合理論長度，重組質粒pSINsi－hU6－siRNA構建成功。

2.3 測序結果 DNA測序結果證實插入正確，檢測序列與預期序列一致（圖3）。

3 討論

Wnt／β－catenin經典信號轉導通路（canonical Wnt／β－cantenin pathway）是 Wnt信號通路中的一支。該通路通過β－catenin的核易位，激活靶基因的轉錄活性［3，4］，在胚胎發育和腫瘤發生發展中具有重要作用。大量研究發現它異常的啟動或時間空間表達都將導致細胞惡變腫瘤發生［5］，并且此通路與細胞凋亡存在廣泛聯系。FRAT1是FRAT家族的分子之一為Wnt／β－catenin信號轉導通路的正相關因子。此基因位于人10號染色體長臂（10q24.1），分子量29KD，共包含279個氨基酸。其在與糖原合成酶激酶－3β（GSK－3β）結合之后抑制β－catenin的磷酸化，使胞漿內游離的β－catenin升高，然后胞漿內積聚的多量β－catenin進入胞核與 TCF／LEF家族結合并激活靶基因轉錄［6］。研究發現，FRAT1在多種腫瘤中都出現高表達［7－9］。但未見結腸癌相關報道。

圖2 提取純化的6組質粒目的基因PCR凝膠電泳圖片

圖3 pSINsi－hu6siRNA 測序圖

研究FRAT1對結腸癌細胞的影響，首先沉默掉這一基因而后才能觀察癌細胞的變化，這就需要RNAi技術的幫助。研究發現，針對同一個靶基因的不同siRNA序列其沉默效率也有差異［10］，為了更有效地沉默靶基因，設計出與靶基因高度同源且不與其他基因同源的siRNA序列是RNA干擾特異性的關鍵［11］，也是本實驗的關鍵步驟。

本實驗詣在針對FRAT1基因的不同位點設計合成siRNA序列的小干擾片段，結果顯示載體中有完整的shRNA 序列，得到重組質粒pSINsi－hU6－siRNA9（CTF181－1－1）及陰性對照組 CFT181－N－1，證實FRAT1的RNAi載體成功構建，為進一步轉染至結腸癌細胞沉默FRAT1基因，研究這一基因對癌細胞增殖凋亡侵襲的影響奠定了基礎。我們將繼續此方面研究。

［1］Freemantle S J，Portland H B，Ewings K，et al.Characterization and tissue－specificexpression of human GSK－3－binding proteins FRAT1and FRAT2［J］.Gene，2002，291（1－2）：17.

［2］Miller J R，Hocking A M，Brown J D，et al.Mechanism andfunction of signal transduction by the Wnt／beta－catenin and Wnt／Ca2＋pathways［J］.Oncogene，1999，18（55）：7860.

［3］Moon R T，Bowerman B，Boutros M，et al.The promise and perils of Wnt signaling through beta－catenin［J］.Science，2002，296（5573）：1644.

［4］Akiyama T.Wnt／beta－catenin signaling［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2000，11（4）：273.

［5］Wodarz A，Nusse R.Mechanisms of Wnt signaling in development［J］.Annu Rev Cell Dev Biol，2007，14：59.

［6］Dajani R，Fraser E，Roe S M，et al.Structural basis for recruitment of glycogen synthase kinase 3beta to the axin－APC scaffold complex［J］.EMBO J，2003，22（3）：494.

［7］Wang Y，Hewitt S M，Liu S，et al.Tissue microarray analysis of human FRAT1expression and its correlation with the subcellular localisation of beta－catenin in ovarian tumours［J］.Br J Cancer，2006，94（5）：686.

［8］Wang Y，Liu S，Zhu H，et al.FRAT1overexpression leads to aberrant activation of beta－catenin／TCF pathway in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Int J Cancer，2008，123（3）：561.

［9］Zhang Y，Yu J H，Lin X Y，et al.Overexpression of Frat1correlates with malignant phenotype and advanced stage in human non－small cell lung cancer.Virchows Arch，2011，459（3）：255.

［10］Doench J G，Petersen C P，Sharp P A.siRNAs can function as miRNAs［J］.Genes Dev，2003，17（4）：438.

［11］Naito Y，Yamada T，Ui－Tei K ，et al.siDirect：highly effective，target－specific siRNA design software for mammalian RNA in－terference［J］.Nucleic Acids Res，2004，32（Web Server issue）：W124.