Ezrin影響膠質瘤在裸鼠腦內的浸潤性生長

劉乃杰，方 威，趙叢海，秦治剛，金星一，孫利波，房曉萱

（吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033）

腦膠質瘤是最常見的、致死的神經系統腫瘤，約占CNS惡性腫瘤的80%。最普遍的和侵襲性最強的神經膠質瘤是第四級神經膠質瘤（多形性膠質母細胞瘤（GBM）），惡性度高，且耐化療［1］。盡管有最佳的臨床治療，但神經膠質瘤的預后極差，平均生存期為12到15個月［2－4］。原因是神經膠質瘤呈彌漫性生長，腫瘤細胞浸潤周圍正常的腦組織。因此，外科手術很難切除，殘余的腫瘤導致復發。據報道Ezrin基因是橫紋肌肉瘤（RMS）和骨肉瘤轉移的關鍵因子［5］，其高表達可促進乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和骨肉瘤等腫瘤的轉移［5－10］。另據報道，Ezrin在腦膠質瘤的表達上調［11，12］，但與腦膠質瘤浸潤性生長的機制的關系不清楚。因此，本文對腦膠質瘤細胞U87的Ezrin沉默或過表達，觀察其在裸鼠腦內的遷移及浸潤生長情況，探索腦膠質瘤生長特點的機制，為治療尋找新的靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

EcoRⅠ、XhoⅠ，DNA Ligation Kit Ver.2.0，pMD○R18－T Vector，Ribonuclease Inhibitor，TaKa－Ra LA Taq○RHot Start Version，Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0，DL2，000DNA Marker、DL10，000DNA marker，大腸桿菌感受態細胞DH5α，寶生物工程（大連）有限公司；限制性內切酶BbsⅠ、BamHⅠ、PstⅠ，λDNA／Eco130l，MBI Fermentas公司；pGPU6／GFP／Neo載體，上海吉瑪制藥技術有限公司；M－MLV反轉錄酶，Promega；質粒小量提取試劑盒，杭州愛思進生物技術有限公司；低分子量蛋白 marker（16－105kD），北京鼎國生物技術有限公司；TRIzol，脂質體 LipofectimineTM2000，Invitrogen公司。抗人Ezrin抗體，Cell Signaling Technology公司；HRP標記二抗IgG，DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。DMEM培養基，Life Technologies；小牛血清，Hyclon；引物、測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。人膠質瘤細胞株U87，購自中國科學院細胞庫。BALB／c裸鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 構建Ezrin基因shRNA載體并篩選有效的iRNA 根據GenBank登錄的Ezrin基因，應用Designer3.0（Genepharma）軟件設計4個不同位點的shRNA DNA oligo，合成并克隆至shRNA載體pGPU6／GFP／Neo載體，轉化后，小量提取質粒，經BamHⅠ、PstⅠ酶切及測序鑒定后，以脂質體LipofectimineTM2000介導分別轉染U87細胞，詳細過程按說明書操作。轉染后48h熒光顯微鏡下觀察轉染情況，收集轉染細胞，RT－PCR及Western blot檢測Ezrin表達量的變化。Ezrin檢測引物EF2：5’－TCGACAAGAAGGCACCTGAC－3’，ER2：5’－CTGTCTCTCCAGCTCCTCCT－3’，擴增產物420bp。

1.2.2 Ezrin基因表達載體的構建及鑒定

1.2.3 應用裸鼠腦瘤模型檢測Ezrin基因沉默及過表達對U87細胞浸潤性生長的影響的影響

0.25%胰酶消化轉染基因的U87細胞，PBS洗滌，計數、備用。裸鼠以4%水合氯醛（400mg／kg體量）腹腔麻醉后，固定于立體定位儀。常規消毒、鋪巾，確定進針位置：前鹵門前1mm，矢狀縫右側1.8mm處，深度3.5mm，用10μl微量進樣器吸取5μl U87細胞懸液（1×108／ml），緩慢注入裸鼠腦尾狀核內，注射后留針10min。每天觀察并記錄裸鼠狀態。21天后處死，解剖，剝離腦組織，冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察腫瘤細胞的生長情況。

2 結果

2.1 構建Ezrin基因shRNA載體并篩選有效的iRNA

2.1.1 酶切鑒定Ezrin基因shRNA重組質粒

將合成的Ezrin shRNA的Oligo DNA退火后克隆至pGPU6／GFP／Neo載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α后，提取質粒，BamHⅠ、PstⅠ分別酶切，如圖1，被BamHⅠ切開的、不能被PstⅠ切開的為陽性重組質粒。選取2個質粒測序。

圖1 BamHⅠ、PstⅠ酶切鑒定Ezrin基因shRNA重組質粒

2.1.2 Ezrin基因shRNA重組質粒測序及分析

每個克隆載體選取2個質粒測序，并應用NCBI網站的 Align two（or more）sequences using BLAST（bl2seq）對所測得的序列與理論序列進行比對分析，分析結果顯示所測序列與理論序列完全一致，表明克隆的Ezrin shRNA oligo DNA是正確的（圖2）。

圖2 Ezrin基因shRNA重組質粒序列分析

2.1.3 有效Ezrin shRNA載體篩選 Ezrin shRNA載體以脂質體LipofectimineTM2000介導轉染U87細胞，48h后，收集細胞，提取細胞RNA和蛋白，RT－PCR檢測Ezrin mRNA的表達，顯示shR－NA－Ezrin－2轉染組細胞其表達量降低，如圖3。Western blot 檢 測 顯 示 shRNA－Ezrin－2 轉 染 組Ezrin蛋白的量降低，如圖4。因此shRNA－Ezrin－2為有效干擾載體。

圖3 RT－PCR鑒定Ezrin mRNA在shRNA載體轉染的細胞的表達

圖4 Western blot鑒定Ezrin蛋白在shRNA轉染細胞的表達

2.2 裸鼠腦瘤模型檢測Ezrin基因沉默及過表達對U87細胞浸潤性生長的影響

裸鼠腦注射轉基因的U87細胞21天，處死、解剖，剝離出腦組織，冰凍切片后，激光共聚焦顯微鏡下觀察可見，與對照組對比，shRNA－Ezrin－2轉染組遷移細胞數少，而pEGFP－C1／Ezrin轉染組遷移細胞相對較多（圖5），表明Ezrin基因沉默可阻斷U87細胞浸潤性生長，過表達可促進U87遷移，增強其浸潤生長。

3 討論

圖5 Ezrin基因沉默及過表達對影響U87細胞在裸鼠腦內的浸潤性生長

腦膠質瘤具有發病率高、死亡率高、復發率高等特點，是中樞神經系統疾病的難點［13，14］。手術切除和放射治療（RT）輔以化療是當前治療標準，但神經膠質瘤對治療抵抗，主要因素是神經膠質瘤具有彌漫性生長的天性，腫瘤細胞浸潤鄰近正常的腦組織，因此，外科切除術難以切除，殘余的腫瘤無疑導致復發；神經膠質瘤高劑量的放射治療受正常組織毒性影響大腦功能的限制；神經膠質瘤又因天然的血腦屏障（BBB）排斥化學療法和其他有針對性的治療方法使治療效果較差。盡管神經影像學的發展和術中腫瘤示蹤技術的應用使腦膠質瘤的治療取得了一定的進展，但也難以保證以手術為主的治療能完全根除腫瘤，其根本原因是腦膠質瘤的生長特點決定的。

腫瘤轉移是惡性腫瘤的生物學特點，細胞運動能力增強導致其遷移和侵襲，細胞骨架的重塑是直接原因，而Ezrin作為肌動蛋白與細胞膜及膜表面受體連接的橋梁，在腫瘤侵襲轉移過程中具有樞紐作用［15］。Bruce等［16］應用組織芯片檢測了5000例標本包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結腸癌及正常組織的Ezrin的表達，結果顯示Ezrin在腫瘤組織中呈高表達，且與腫瘤組織的分級及預后密切相關。在Kobel［17］的實驗中164例FIGO分期Ⅰ期的子宮內膜癌，有93%Ezrin高表達，而且表達Ezrin的腫瘤細胞之間的連接比較松散。Khanna等［18，19］用cDNA微列陣技術檢測發現，Ezrin在高侵襲性的K2M7腫瘤細胞中的表達量高于低侵襲性的K12腫瘤細胞3倍，Wan等［20］應用反義Ezrin或siRNA阻斷Ezrin的表達，可顯著減少K2M7骨肉瘤鼠的肺轉移發生率。Ezrin使腫瘤細胞具有高轉移活性的另一個例證［21］是將Ezrin基因轉染轉移能力較低的細胞系，可使其轉移能力顯著提高。Tynninen O［11］檢測229例原發和復發性星形細胞瘤患者（WHO分級Ⅱ－Ⅳ）、113例少突膠質細胞瘤（Ⅱ－Ⅲ）和寡樹突神經膠質性和星狀神經膠質性膠質瘤（oligoastrocytomas）（Ⅱ－Ⅲ）患者Ezrin的表達，發現Ezrin在星形細胞瘤表達最強（P＝0.006），少突膠質細胞瘤Ezrin的表達也是陽性，并且隨著腫瘤級別的增加其表達增加（P＜0.05）；Ezrin與星形細胞瘤和寡樹突神經膠質性和星狀神經膠質性膠質瘤（oligoastrocytomas）的惡性度相關（P＝0.001），周龍等［12］的研究也證實了這一點。

因此本文以Ezrin基因shRNA載體和過表達載體分別轉染U87細胞，接種裸鼠腦組織。21天后取腦瘤模型鼠腦組織，冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察可見，與對照組對比，shRNA－Ezrin－2轉染組遷移細胞數少，而pEGFP－C1／Ezrin轉染組遷移細胞相對較多，表明Ezrin基因沉默可阻斷U87細胞浸潤性生長，過表達可促進U87遷移，增強其浸潤生長。至于其體內生長特點的機制有待深入研究。

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