苯乙酸聯合5－氟尿嘧啶、順鉑對喉癌細胞株凋亡的影響及在荷瘤鼠動物模型中的作用觀察

吳志圣，趙 明，金春順，陳 鷗

（吉林大學第二醫院 耳鼻喉頭頸外科，吉林 長春130041）

苯乙酸（phenylacetate acid，PA）是正常生物體中苯丙氨酸脫氨基的代謝產物，目前的文獻［1－3］表明，PA可以在體內和體外抑制多種腫瘤細胞的生長和增殖。臨床證明單一用藥苯乙酸往往不能根治腫瘤，停藥后腫瘤容易復發，故國內外的學者均主張聯合化療加放療治療以提高療效。我們采用苯乙酸聯合應用5－Fu、CDDP作用于喉癌細胞，應用流式細胞儀、荷瘤鼠模型等方法，觀察聯合用藥組與單一藥物組對喉癌細胞凋亡作用，并制作荷瘤鼠模型進行動物體內實驗。初步探討苯乙酸是否可以增強化療對喉癌細胞的凋亡作用，是否可以減少化療的毒副作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人喉癌細胞株Hep－2購自中科院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所。苯乙酸（PA）由北京長城化學試劑公司由吉林省應化物理所提供。RPMI－1640人工合成培養液購自GIBCO。胎牛血清為Hyclone公司產品。5－Fu及順鉑購于江蘇豪森藥業股份有限公司。EM－1200EX型透射電子顯微鏡為日本產品。LKB－Ⅲ型超薄切片機為瑞典產品。流式細胞儀Becton Dickinson產自美國。荷鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。鼠黑色素瘤細胞B16購自中科院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所。統計學分析：采用SPSS獎懲10.0軟件進行方差分析和t檢驗。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞儀的檢測 流式細胞儀檢測Hep－2細胞周期各時相的變化及細胞凋亡率。

1.2.2 取對數生長期的人喉癌細胞株 Hep－2細胞，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞后制備成單細胞懸液，細胞培養，培養結束后收集細胞。

1.2.3 以900rpam／min離心，5min，PBS洗兩次；

1.2.4 70%乙醇重懸細胞，并使之固定12h以上；

1.2.5 取96孔培養板，每2孔為一組，每孔加入準備的Hep－2細胞2×104／孔，每孔按預實驗得到最佳抑瘤作用劑量加入不同濃度的PA、5－Fu和順鉑：PA 濃度20mg，5－Fu 20mg，CDDP 8mg，PA＋5－Fu＼20mg＋20mg，PA＋CDDP＼20mg＋8mg，并設對照組。于37℃5%CO2培養箱內培養，分別在24h終止培養。PBS洗兩次，調細胞濃度為1×106個／ml，RNAase消化后，加入 1.5ml PI（碘化丙啶5 mg／100ml）染色1h，過4S目網，上機檢測，混勻后上流式細胞儀做單參數分析，每份樣品檢測1×104個細胞。GI峰前面出現的亞2倍體峰即為凋亡峰。

1.3 荷瘤鼠動物模型的建立及分組治療

1.3.1 鼠黑色素瘤細胞復蘇、培養、凍存方法。C57BL／6小鼠荷B16腫瘤模型的建立及分組治療。

1.3.2 鼠C57BL／6，雄性鼠30只，6－8周齡，體重18g。

1.3.3 方法 取對數生長期的鼠黑色素瘤B16細胞，用無血清 Hank’s洗滌2次后，調整細胞濃度為4×106個／ml，于鼠左后肢皮下注射鼠黑色素瘤B16細胞0.5ml（含細胞2×106），于接種的第5天將荷瘤鼠隨機分為6組，每組5只。第一組：單純給PA組，第二組：單純CDDP組，第三組：單純5－Fu組，第四組：PA＋CDDP組，第五組：PA＋5－Fu組，第六組：生理鹽水對照組。每只鼠接種PA均右側皮下給藥，注射量為0.5ml，濃度20μg／日。5－Fu及順鉑為胃腸給藥，5－Fu 20μg／日，順鉑：6mg／日，每日給藥一次，連續5天后停一天給藥，共計給藥14日，將鼠處死，測量瘤鼠左下肢腫瘤大小及重量，并作病理形態學觀察。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測

流式細胞儀檢測結果表明，分別用PA、5－Fu、CDDP及 PA＋5－Fu、PA＋CDDP作用 Hep－2細胞24h后，出現了凋亡峰，即流式細胞儀分析PI染色后低于G0／G1期出現的亞二倍體峰。結果顯示，PA增強5－Fu、CDDP對Hep－2的細胞的凋亡作用，對CDDP的作用更為顯著，與單一用藥組比具有顯著差異性，P＜0.05，藥物作用后細胞各時相變化及凋亡率與對照組比較差異非常顯著，P＜0.01，并且呈劑量依賴性增加，而對照組未見或僅見較低的二倍體峰（圖1－5）。

圖1 PA 20mg凋亡率3.9%

圖2 5－Fu 20mg凋亡率2.59%

圖3 CDDP 8mg凋亡率5.61%

圖4 PA＋5－Fu／20mg＋20mg凋亡率5.30%

圖5 PA＋CDDP／20mg ＋8mg凋亡率9.83%

2.2 荷瘤鼠聯合用藥狀況

2.2.1 在給藥后7日內各組小鼠反應靈敏，毛順，色澤光滑，飲食正常，體重增長較快，各組小鼠體重增長無顯著差異。自實驗第8日起，5－Fu、CDDP組鼠出現厭食、倦縮懶動，體重增長減慢，對照組至實驗結束出現全身重量減輕，瘤體增長快，鼠一般狀態欠佳，怠倦。PA＋5－Fu及PA＋CDDP組出現上述癥狀時間晚，于給藥半個月后才出現上述癥狀，且癥狀輕，以PA組鼠狀態最好。從生存率看鼠實驗中共計死亡4只：5－Fu組2只，CDDP組1只，PA＋5－Fu組1只。5－Fu組于用藥第8天給藥時，死亡1只，在給藥第14天不明原因死亡1只，CDDP組，于第15天不明原因死亡1只；PA＋5－Fu組注射第7天1只鼠出現頸部皮下氣腫，于次日死亡，從實驗結果看，5－Fu組、CDDP組鼠死亡較高，而聯合用藥組、PA組鼠生存時間較長。

2.2.2 測鼠體重開始14天內，測量各組鼠體重無明顯變化。14天后，腫瘤對照組隨著瘤體迅速增大，體重增加較明顯。但25天后，鼠體重減輕，單一化療用藥組，實驗前期，鼠體重增長較對照組比顯著差異。實驗后期，鼠體重明顯減輕，呈衰竭狀態，鼠死亡較多。聯合用藥組PA＋5－Fu、PA＋CDDP組，鼠體重略減輕。鼠瘤體大小測量顯示，對照組瘤體增長較大，而PA＋CDDP組，瘤體變小，（表1）測量瘤體重結果對照組與聯合用藥組PA＋CDDP組比，差異具有顯著性。

2.2.3 腫瘤病理形態學觀察HE染色顯示，PA組無病變，而5－Fu組一只鼠有肺部炎癥改變且較重；PA＋CDDP組，一只鼠也有炎癥改變，但較輕，（圖6、圖7）。瘤體HE染色顯示對照組瘤細胞生長結構完整，細胞形態良好，而聯合用藥組瘤體內細胞有較多壞死灶（圖8、圖9），說明聯合用藥組對瘤體產生了抑制殺傷作用。

表1 PA、CDDP、5－Fu及聯合用藥組15天的瘤體重 ±s／g

表1 PA、CDDP、5－Fu及聯合用藥組15天的瘤體重 ±s／g

＊＊P＜0.01 ＊P＜0.05

分組nˉx±s 5 2.81±0.53 CDDP組 4 2.46±0.36 5－Fu組 3 2.83±0.42 PA＋CDDP組 5 2.09±0.71＊＊PA＋5－Fu組 4 2.33±0.51＊對照組PA組5 3.12±0.24

圖6 荷瘤鼠PA組、肺組織無病變 光鏡200×

圖7 5Fu組荷瘤鼠肺組織炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增厚、塌陷、光鏡200×

圖8 對照組大部分細胞形態良好，結構完整 光鏡200×

圖9 PA＋CDDP組腫瘤細胞可見壞死灶 光鏡200×

表結果表明，PA 聯合CDDP及5－Fu后，對B16荷瘤小鼠抑癌作用與對照組相比，差異顯著，而單一用藥組與對照組相比雖然無統計學意義，但瘤體重量有減輕趨勢。

3 討論

本實驗流式細胞儀細胞周期分析表明：PA、5－Fu、CDDP、PA＋5－Fu、PA＋CDDP，對 Hep－2細胞周期均有影響，即將 Hep－2細胞周期阻滯于G1期［4－7］，G1期細胞增多，同時伴S期細胞減少［8］。使G2／M期細胞減少，細胞凋亡率上升。腫瘤細胞可分為增殖細胞與非增殖細胞兩種：增殖細胞與腫瘤生長直接有關，對抗腫瘤較敏感，是化療重要攻擊目標。而PA作用下使這種作用產生了協同增強效應，故PA＋5－Fu或PA＋CDDP化療藥物的療效比較單一5－Fu以及CDDP作用明顯增強。

胡國華［9］等用嗜銀蛋白檢測技術預測頭頸腫瘤化療藥物的敏感性，共59例，喉鱗癌38例，喉咽鱗癌2例，鼻咽鱗癌16例，鼻腔惡性淋巴瘤2例，耳廓鱗癌1例，均經病理證實。實驗所測得的敏感藥物順序大致與臨床結果符合，其敏感性較好的藥物如：CDDP、VCR（長春新堿）與5Fu，PYM（平陽霉素）等是目前頭頸腫瘤化療中首選，這與我們實驗結果相符合，同樣在PA作用下，以CDDP對PA的作用更為敏感，說明在頭頸腫瘤化療治療應以CDDP為基礎。PA增強化療藥CDDP對喉癌細胞珠Hep－2凋亡途徑［10］。

5－Fu、CDDP是臨床上常用的化療藥物，具有較強的抑瘤作用，但作為一種免疫抑制劑，臨床應用時毒副作用較大。在荷瘤鼠B16動物模型治療研究中，采用了胃腸給藥及健側皮下給藥方式，可以排除PA及5－Fu、CDDP局部用藥而對腫瘤所產生的直接毒性作用。從一般狀態上及病理上觀察，研究結果表明聯合給藥組小鼠腫瘤受到抑制，其中以PA＋CDDP組最明顯，瘤體體積縮小明顯，PA聯合CDDP及5－Fu后，對B16荷瘤小鼠抑癌作用與對照組相比，差異顯著。說明荷瘤鼠對5－Fu、CDDP不耐受，可能與化療毒副作用有關。分析5－Fu、CDDP兩組，不明顯原因死亡的荷瘤鼠，可能和化療藥物的毒性作用及并發癥有關。實驗表明PA在動物體內無毒副作用或者毒副作用很低，動物對其有很好的耐受。

腫瘤生物化學療法（Biochemotherapy）是生物治療和化學治療聯合應用于腫瘤的全新綜合治療模式，但是化療一般多為細胞毒藥物，靶向性不強，在殺傷腫瘤細胞的同時明顯影響患者造血、免疫和某些器官（系統）的功能，易產生多藥耐藥而失敗。化療和生物治療的聯合往往可以起到相加或協同治療的作用。

本實驗說明苯乙酸和5－Fu、CDDP化療藥物聯合應用可以明顯增強對 Hep－2細胞生長增殖抑制作用，促進細胞形態轉化，顯著提高促凋亡作用。荷瘤鼠動物模型治療，PA＋CDDP組與PA＋5－Fu聯合用藥組腫瘤體積縮小，具有顯著性，瘤體抑癌率較單一用藥組明顯提高，化療藥物的毒副作用于苯乙酸聯合應用后可以減輕，荷瘤鼠治療的實驗為喉癌化療治療提供了新的思路。并且減少化療藥物劑量及減少耐藥性，減輕毒副作用及并發癥的發生，為喉癌臨床治療提供了理論基礎。

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