miR－31在人結腸癌細胞系HT－29對RhoBTB1表達的影響

徐瑞斯，張 斌

（吉林大學中日聯誼醫院 內鏡中心，吉林 長春130033）

結腸癌（colon cancer）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，每年死亡病例居各種惡性腫瘤第三位［1］。目前為止，根治結腸癌最有效的方法還是手術切除聯合化療，對于局部腫瘤5年生存率達到93%［2］。microRNA（miRNA）是一種大小19－24個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，能夠通過排序這些基因的3’段非編碼區調整下游目標基因，參與細胞增殖、分化、凋亡等多種重要細胞活動的調控［2］。迄今為止，人們發現了1500多種miRNA序列［3］。越來越多的證據表明miRNA在腫瘤的發生和進展中起著非常重要的作用［4，5］，很多miRNA在腫瘤中的表達是上調的或者是下調的［6，7］。

miRNA－31在惡性腫瘤的發生中起著非常重要的作用。有報道稱miRNA－31結腸癌表達是顯著上調，而且其表達水平在結腸癌的各個階段是相互關聯的［8，9］。有報道稱 miRNA－31與結腸癌的侵襲和轉移有關，抑制miRNA－31的表達可以影響結腸細胞的遷移和侵襲［10］。RhoBTB是Rho家族小分子鳥苷酸三磷酸酶（Rho GT Pases），是RhoBTB亞家族成員。最近報道指出在頭頸癌中，RhoBTB1也是一種抑癌蛋白［11］。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人結腸癌細胞株HT－29來自于美國標準生物品收藏中心（ATCC），為復旦大學李志剛老師惠贈。90%RPMI1640培養基，10%胎牛血清，加100U／ml青霉素和100U／ml鏈霉素，于37℃，5%CO2培養箱中培養。

1.2 細胞轉染 對照RNA和miR－31mimics分別轉染HT－29細胞。將細胞在轉染之前24h接種到24孔板上（2.5－3×104／well）。取1μl轉染試劑 Lipofectamine 2000（Invitrogen）加入50μl（不含抗生素及血清）培養液中，同時將1.25μlmiR－31mimics儲存液加入50μl（不含抗生素及血清）培養液中。將兩者混勻后加400μl（不含抗生素及血清）培養液，加入培養液清洗后的培養細胞上。37℃培養5－6h，換液。37℃5%CO2培養箱培養48h之后，收集細胞進行檢測。

1.3 預測靶基因 使用在線miRNA靶基因預測數據庫（http：／／www.targetscan.org），我們假定RhoBTB1是miR－31的靶蛋白。（如圖1A）

1.4 熒光素酶報告基因載體的構建 采用PCR方法擴增RhoBTB1基因的3’UTR序列，并構建其突變型序列，擴增出來的序列經酶切后，連入pGL3載體螢火蟲熒光素酶序列的3’端，所有構建好的質粒均經DNA測序檢驗。

1.5 熒光素酶基因報告分析 將培養好的細胞于轉染之前24h接種到24孔板中，將熒光素酶報告質粒與miR－31mimics共同轉染細胞，48h之后進行熒光素酶活性的測定。

1.6 RT－PCR 用TRIzol試劑（Invitrogen）從細胞和腫瘤組織中提取總RNA。我們用莖環RT－PCR方法進行miR－31的檢測。RhoBTB1mRNA的檢測使用M－MLA反轉錄系統（Promega）將RNA逆轉錄 成cDNA。qRT－PCR的使用SYBR Green qPCR Master Mix（Tiangen）在 ABI 7300（Applied Biosystems，Foster，CA）。GAPDH作為內參。

1.7 western－blotting 按指示轉染后，細胞收集并在RIPA裂解緩沖液（150mM NaCl，10mM Tris，pH7.5，1%NP40，1%脫氧膽酸鹽，0.1%SDS，蛋白酶抑制劑混合物（sigma））裂解和使用Bradford protein assay（Bio－Rad，Hercules，CA）測定總蛋白。等量的蛋白樣品進行10%SDS－PAGE電泳，并轉移到PVDF膜（Millipore，Billerica，USA），室溫下在5%脫脂牛奶封閉30min，然后室溫下在anti－RhoBTB1（1∶2000，Abcam）中孵育2h，隨后室溫下加山葵過氧化物酶連接二抗孵育1h，使用ECL（Millipore，MA，USA）觀察。β－actin（1∶5000，Abcam）作為內參。

1.8 統計學處理

采用SSPS12.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，應用統計方法t檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 RhoBTB1是 microRNA－31的靶蛋白

由于miRNA的調控目標基因mRNA的翻譯和凋亡是通過和靶基因3＇UTR的直接結合而相互作用，我們試圖尋找miR－31的靶基因，以進一步揭示其結腸癌發生機制中的影響。通過使用miRNA靶基因預測的數據庫（http：／／www.targetscan.org），我們假定 RhoBTB1為 miR－31的靶基因（圖1A）。研究RhoBTB1是否為miR－31的直接靶基因，我們應用了熒光素酶報告基因檢測。

首先，我們構建了熒光素酶報告質粒包含RhoBTB1 3＇UTR序列（WT－RhoBTB1）或刪除預測的 miR－31的靶基因位點（mut－RhoBTB1）。如顯示在圖1B后，共同轉染的wt－RhoBTB1質粒，與對照miR轉染的細胞，miR－31轉染的細胞的熒光素酶活性的顯著減少，而與mut－RhoBTB1質粒共同轉染的細胞熒光素酶的活性沒有改變。兩者合計，這些結果表明了miR－31針 對3＇UTR直接調控RhoBTB1。

圖1 A 靶基因預測數據庫中miR－31靶基因的預測結果

圖1 B miR－31轉染HT－29細胞后，熒光素酶的檢測結果

2.2 miR－31的下調RhoBTB1在HT29細胞中的表達

RhoBTB是Rho家族小分子鳥苷酸三磷酸酶，由3名成員組成，有報道稱兩名成員RhoBTB1和RhoBTB2為抑癌基因。我們發現RhoBTB1為人結腸癌細胞系HT29中miR－31的靶蛋白，接下來我們研究miR－31對RhoBTB1表達的影響。與轉染對照RNA的 HT29細胞相比，轉染miR－31mimics HT29細胞的RhoBTB1mRNA表達水平顯著下調（圖2A），western－blotting結果顯示miR－31表達抑制之后RhoBTB1蛋白表達水平上調（圖2B）。在結腸癌組織中miR－31的上調抑制RhoBTB1的表達。

圖2 A miR－31mimics轉染HT－29細胞，RhoBTB1的mRNA表達水平比較

圖2 B miR－31mimics轉染HT－29細胞，RhoBTB1的蛋白表達水平比較

3 討論

miRNA是內源性表達的小非編碼RNA，它控制目標信使RNA基因的表達。據估計，在人類，基因編碼的miRNA的數量約3%，這可能調節30%蛋白質的編碼基因［12，13］。確實的證據說明，miRNA人類癌組織中表達異常，在腫瘤的發生和發展中發揮著重要作用［14，15］。

為了確定 miR－31的靶基因，我們使用TargetScan sorftware，分析結果表明，腫瘤抑癌基因RhoBTB1的可能是miR－31的靶基因。RhoBTB1屬于RhoBTB亞家族。RhoBTB蛋白是Rho家族小分子鳥苷酸三磷酸酶的非典型成員。Rho GTP酶作為分子開關調節肌動蛋白，被認為是細胞骨架重構的主要調節分子，越來越多的證據表明，他們也參與調節細胞周期和細胞凋亡，也有報道稱Rho GTP酶參與腫瘤的發展［16－18］。

RhoBTB亞家族被證實是在2001年在真核細胞盤基網柄菌的基因編碼Rho－相關蛋白的研究中。和其他典型的RhoGTPases不同，RhoBTB蛋白質不是調節肌動蛋白系統。現在，RhoBTB的家族兩名成員，RhoBTB2和RhoBTB1，被認為是腫瘤抑制蛋白。RhoBTB1，位于10q21，在（HNSCC）的發展有一定的作用。

我們的研究表明，抑癌蛋白RhoBTB1是miR－31的靶蛋白。microRNA－31能夠下調RhoBTB1在HT29細胞中的表達量。miRNA－31在調控腫瘤的發生和發展中起著重要的作用。對miRNA的深入研究無疑能增進對大腸癌發生、發展、轉歸等機制的認識，促進診斷和治療的快速發展。闡明大腸癌相關miRNA的作用機制將可能豐富大腸癌的病因學及分子病理學理論，為大腸癌診斷治療提供新策略和思路。如能根據此研究研制出抗腫瘤新藥，給社會及經濟方面帶來深遠的影響。

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