抑癌基因IL－24在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義

李正祎，李 艷，郭素紅，孫可欣，李 欣，袁忠海

（吉林醫(yī)藥學(xué)院 檢驗(yàn)系，吉林 吉林132013）

隨著我國生活水平的不斷提高，近年來乳腺癌增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯，并且出現(xiàn)了低齡化趨勢(shì)［1］。乳腺癌發(fā)展的最終結(jié)果是出現(xiàn)全身的系統(tǒng)性轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因，也是目前臨床上的治療難點(diǎn)。如何抑制乳腺癌的細(xì)胞生長(zhǎng)，阻斷癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，是目前乳腺癌治療研究的熱點(diǎn)之一。癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟，多基因參與的過程，包括原癌基因的活化，抑癌基因的失活等許多相關(guān)基因的突變。近些年基因治療已取得了較大成就，它被看成是對(duì)先天和后天基因疾病有效治療的新途徑［2］。

IL－24基因最初是從IFN和MEZ誘導(dǎo)分化的人黑色素瘤細(xì)胞中克隆來的，最初命名為 MDA－7（melanoma differentiation－associated antigen，MDA－7）［3］。人IL－24定位于1號(hào)染色體的1q32.2－q41。IL－24全長(zhǎng)cDNA約為117kb，有一個(gè)編碼206個(gè)氨基酸的完整開放讀碼框架，分子量為23.8 kD［4］。IL－24是一種既可特異抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和血管形成，并靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)SU等［5］采用一系列方法深入研究還發(fā)現(xiàn)IL－24具有抗腫瘤旁殺傷效應(yīng)。研究表明惡性乳腺癌組織IL－24基因呈顯著性低轉(zhuǎn)錄和低表達(dá)，其降低程度與病理惡變程度相關(guān)［6］。本研究將IL－24基因轉(zhuǎn)入 MDA－MB－231細(xì)胞中，以探尋其對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成等方面的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株 MDA－MB－231為本室保存；穿梭質(zhì)粒pDC316－EGFP購自北京本元正陽基因技術(shù)有限公司，含有目的基因IL－24片段的穿梭質(zhì)粒pDC316（pDC316－h(huán)IL－24－EGFP）由本室合成；質(zhì)粒抽提和純化試劑盒購自杭州博日科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine2000、Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；新生小牛血清購自杭州賽樂生物科技公司；IL－24抗體購自abcam公司；PCR擴(kuò)增的上下游引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24h將人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞分別以每孔4×104、2×105接種到24、6孔板上，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)70%－80%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，加入適量重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以空質(zhì)粒pDC316－EGFP和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照。

1.3 IL－24基因高表達(dá)的檢測(cè)

1.3.1 倒置熒光顯微鏡 轉(zhuǎn)染48h后24孔板觀察細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的情況，判斷轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 RT－PCR檢測(cè)IL－24、MMP－2、MMP－9基因的轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)染48h后從6孔培養(yǎng)板收集各組細(xì)胞，用Trizol法分別抽提總RNA，分別用IL－24、MMP－2、MMP－9及內(nèi)參 GAPDH 引物進(jìn)行 RT－PCR，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后外源性 IL－24 基因、內(nèi)源性 MMP－2、MMP－9基因和內(nèi)參GAPDH基因在 MDA－MB－231細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。IL－24 引 物 為：上游 5′－GCACTCGAGCCATGAATTTTCAACAGAGGCTGCA－3′，下游5′－GCTTCT AGATCAGAGCTTGTAGAATTTCTG －3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度620bp。MMP－2引物為：上游5′－GAATACCATCGAGACCATGCG－3′，下游 5′－GCCATACTT CACACGGACCAC－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度405bp。MMP－9引物為：上游5′－ACCTT CACTCGCGTGTACAGC－3′，下游 5′－GCGGAGTAGGATTGGCCTTG－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度439bp。GAPDH 引物為：上游5′－TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAA－3′，下游5′－TCCTTGGAGGCCATGTGGGCC－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度240bp。

1.3.3 Western blot檢測(cè)IL－24基因的表達(dá) 收集6孔板中轉(zhuǎn)染后48h及空白對(duì)照組（PBS組）的細(xì)胞于EP管中。1 500r／min離心，PBS洗滌2－3次，各組細(xì)胞在裂解緩沖液中裂解。蛋白樣品在10%SDS－PAGE膠中分離，再將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜（硝酸纖維膜）上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1h后，分別加入鼠抗IL－24抗體（1∶1 000），37 ℃、2 h，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，再用TBST洗膜5min×3次，最后加化學(xué)發(fā)光底物（ECL Plus），保鮮膜包裹后，于暗室內(nèi)將該硝酸纖維素膜壓于裝有膠片的暗盒內(nèi)，曝光、顯影和定影。

1.4 結(jié)晶紫染色觀察pDC316－h(huán)IL－24－EGFP對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性

將 MDA－MB－231細(xì)胞鋪于24孔板，鋪9孔。24h后加入適量重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染（pDC316－EGFP、pDC316－h(huán)IL－24－EGFP），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4天后吸凈培養(yǎng)基，每孔加入500μl結(jié)晶紫染色液（2%結(jié)晶紫溶于20%甲醇溶液）染色15min，在凈水中將多余的染液洗凈，拍照。

1.5 ELISA測(cè)定 VEGF、Ang－1濃度

用pDC316－EGFP、pDC316－h(huán)IL－24－EGFP分別轉(zhuǎn)染 MDA－MB－231細(xì)胞48h后，1 000r／min離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組。按ELISA試劑盒說明書測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF、Ang－1的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)用±s表示，經(jīng)SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，多組間差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，＊P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因轉(zhuǎn)染結(jié)果

2.1.1 轉(zhuǎn)染后EGFP 的表達(dá) 根據(jù)pDC316－EGFP的特點(diǎn)，轉(zhuǎn)染pDC316－EGFP的細(xì)胞可表達(dá)EGFP，轉(zhuǎn)染重組載體pDC316－h(huán)IL－24－EGFP 可 表 達(dá)IL－24及EGFP蛋白。熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染后各時(shí)段均可見綠色熒光，48h后約60%－70%的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。轉(zhuǎn)染pDC316－EGFP的細(xì)胞熒光相對(duì)明亮，轉(zhuǎn)染pDC316－IL－24－EGFP的細(xì)胞熒光較弱（見圖1）。

圖1 pDC316轉(zhuǎn)染MDA－MB－231細(xì)胞熒光照片（×100）

2.1.2 RT－PCR 檢測(cè)IL－24基因轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)染48h后從6孔培養(yǎng)板收集各組細(xì)胞，提取各組總RNA。用IL－24引物進(jìn)行RT－PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后顯示，pDC316－h(huán)IL－24組的IL－24、GAPDH 出現(xiàn)陽性條帶；空載體組和PBS組均只有GAPDH出現(xiàn)陽性條帶（見圖2）；說明pDC316－h(huán)IL－24中的目的基因IL－24能在 MDA－MB－231乳腺癌細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄。

圖2 RT－PCR 檢測(cè)IL－24mRNA 表達(dá)

2.1.3 Western bolt檢測(cè)IL－24基因在 MDA－MB－231細(xì)胞中的表達(dá) MDA－MB－231乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48h后，分別收集3組細(xì)胞做Western blot分析，結(jié)果顯示各組都見有內(nèi)參照條帶β－actin，但只有pDC316－h(huán)IL－24組在相對(duì)分子質(zhì)量為24 000左右處有特異性條帶（見圖3）。

圖3 各組 MDA－MB－231細(xì)胞系IL－24蛋白表達(dá)

2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)晶紫是一種能夠?qū)φ＜?xì)胞染色而不能對(duì)死亡或凋亡細(xì)胞染色的試劑。從圖4可以看出，24孔板中轉(zhuǎn)染了pDC316－h(huán)IL－24的 MDA－MB－231乳腺癌細(xì)胞比轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組（pDC316－EGFP）及細(xì)胞對(duì)照組的結(jié)晶紫著色淺很多，說明pDC316－h(huán)IL－24對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用比pDC316－EGFP強(qiáng)。而pDC316－EGFP 空載體對(duì) MDA－MB－231乳腺癌細(xì)胞幾乎無毒性作用。

2.3 IL－24誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化

pDC316－h(huán)IL－24轉(zhuǎn)染 MDA－MB－231細(xì)胞72h后，與細(xì)胞對(duì)照PBS組和pDC316－EGFP組相比（見圖5），pDC316－IL－24組的 MDA－MB－231細(xì)胞中的MMP－2、MMP－9基因表達(dá)明顯下調(diào)。

2.4 IL－24對(duì)血管形成素 Ang－1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF表達(dá)的影響

圖4 IL－24對(duì) MDA－MB－231細(xì)胞的作用

圖5 RT－PCR分析 MDA－MB－231乳腺癌細(xì)胞MMP－2和 MMP－9的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

MDA－MB－231細(xì)胞分別用pDC316－EGFP、pDC316－h(huán)IL－24轉(zhuǎn)染處理48h后收取培養(yǎng)上清，經(jīng)ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示（見圖6）：pDC316－h(huán)IL－24組MDA－MB－231乳腺癌細(xì)胞 Ang－1分泌表達(dá)（pg／ml）為（205.6±50.7）與 PBS 組 （457.1±75.6）及pDC316－EGFP組（440.6±68.3）比較，培養(yǎng)上清中血管形成素Ang－1的水平顯著減少（＊P＜0.05）。而PBS組及pDC316－EGFP組比較Ang－1表達(dá)水平差異不明顯（P＞0.05）。VEGF分泌表達(dá)（pg／ml）為（1823±325）與 PBS組（3550±509）及pDC316－EGFP組（3627±524）比較，培養(yǎng)上清中VEGF的水平顯著減少（＊P＜0.05）。而PBS組與pDC316－EGFP組比較VEGF表達(dá)水平差異不明顯（P＞0.05）。

圖6 IL－24作用48h對(duì) MDA－MB－231細(xì)胞分泌 Ang－1、VEGF的影響

3 討論

Mda－7／IL－24抑制腫瘤細(xì)胞主要表現(xiàn)在兩方面。一方面，Mda－7／IL－24具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的潛能，并且此抑制活性不依賴于這些細(xì)胞中其他腫瘤抑制基因（p53，Rb，或p16）的狀態(tài)；另一方面除具有的促調(diào)亡功能外，mda－7／IL－24 還具有潛在的旁觀者效應(yīng)、提高放射療效、誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)［7］，其作為細(xì)胞因子參與免疫活化和選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的雙重特性使mda－7／IL－24的基因轉(zhuǎn)染成為腫瘤基因治療的一個(gè)有效策略。

本實(shí)驗(yàn)選用的穿梭質(zhì)粒pDC316能在細(xì)胞基因組外擴(kuò)增并表達(dá)目的基因，具有多拷貝、強(qiáng)啟動(dòng)、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，它在體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率較高。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pDC316介導(dǎo)的IL－24基因表達(dá)具有明顯的抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用（參見圖4）。腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，也是惡性腫瘤患者的主要死因。人們通過對(duì)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行廣泛研究后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）在腫瘤的的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵的作用［8］。腫瘤細(xì)胞在侵襲和轉(zhuǎn)移過程中必須破壞ECM，而參與破壞細(xì)胞外基質(zhì)的酶類中基質(zhì)金屬蛋白酶類 （Matrix metalloproteinases，MMPs）起主要作用，尤其是 MMP－2、MMP－9與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切。有報(bào)道認(rèn)為MMP－2、MMP－9可以作為乳腺癌惡性程度和判斷預(yù)后的一個(gè)有用的指標(biāo)，并有可能成為藥物治療乳腺癌的靶點(diǎn)［9］。本研究通過RT－PCR分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL－24能明顯下調(diào) MDA－MB－231細(xì)胞MMP－2、MMP－9基因的 mRNA 水平，結(jié)果表明乳腺癌細(xì)胞過表達(dá)IL－24蛋白將對(duì)其侵襲和遷移有明顯的抑制作用。

VEGF是一種強(qiáng)效血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性促有絲分裂原，可以促進(jìn)新生血管的形成，多項(xiàng)臨床研究結(jié)果提示在乳腺癌中，無論腋淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移，VEGF蛋白的表達(dá)均是影響總生存率和無瘤生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。而Ang－1是血管新生過程中的另一關(guān)鍵因子，目前抑制腫瘤的新生血管形成已成為腫瘤治療的又一新領(lǐng)域。本研究提示pDC316－h(huán)IL－24可有效降低乳腺癌細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白、Ang－1蛋白表達(dá)及其分泌至細(xì)胞外的蛋白水平。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明外源性介導(dǎo)IL－24基因的過表達(dá)具有抑制乳腺癌 MDA－MB－231細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的作用。

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