革蘭陰性桿菌產β－內酰胺酶及其耐藥分子機制的研究

馮體玉，徐韞健，李 寧，余 琳

（1.梅州市人民醫院 檢驗科，廣東 梅州514031；2.廣州醫學院第一附屬醫院 檢驗科，廣東 廣州510120）

青霉素和頭孢菌素等β－內酰胺類抗菌藥物在長期使用中，細菌逐漸對其產生抗藥性。β－內酰胺酶的產生是革蘭陰性桿菌對該類抗菌藥物耐藥的主要機制之一，臨床上的β－內酰胺酶主要是ESBLs、AmpC酶和MBL。目前，β－內酰胺酶的傳播機制仍不是很明確，質粒攜帶的β－內酰胺酶耐藥基因在質粒間及質粒與染色體間轉移可能是通過轉座子或插入序列為工具實現的［1］。本文對173株革蘭陰性桿菌進行可疑產酶株篩選，鑒定其基因型，并對β－內酰胺酶周圍的“基因環境”進行了分析，進而對基因元件整合子、轉座子、插入序列與革蘭陰性桿菌耐藥的關系進行探討。

1 材料與方法

1.1 菌株 2010年4月－2010年12月，梅州市人民醫院和廣州醫學院第一附屬醫院檢驗科分離的173株（無重復）革蘭陰性桿菌，大腸埃希菌38株，肺炎克雷伯菌32株，鮑曼不動桿菌30株，銅綠假單胞菌27株，陰溝腸桿菌20株，洋蔥假單胞菌10株，弗勞地枸櫞酸桿菌8株，摩根摩根菌8株。質控菌株：大腸埃希菌 ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603和銅綠假單胞菌ATCC27853均購自衛生部藥品鑒定所。

1.2 主要試劑與儀器 K－B法藥敏紙片購自英國OXID公司，Taq酶、dNTPs、DL2000標志物均購自日本 TaKaRa公 司，VITEK－2GNP藥敏卡和VITEK－2全自動微生物鑒定儀購自法國生物梅里埃公司，PCR擴增儀購自美國Bio－Rad公司，超聲細胞粉碎儀購自寧波新芝公司，超高離心機購自美國Beckman公司。

1.3 PCR引物 均由上海英俊生物公司合成，根據文獻設計如表1。

表1 PCR引物序列表

1.4 細菌藥敏實驗 藥敏試驗用K－B藥敏試驗和VITEK－2GNP藥敏卡進行，結果判定按照美國臨床實驗室標準化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2010制定的規則及標準進行［2］。

1.5 三維試驗 將大腸埃希菌標準菌株ATCC25922按K－B法涂布在MH平板上。在平板的中央貼一張頭孢西丁紙片，從距離紙片5mm處用無菌刀片在平板的瓊脂上向外切一裂隙。每一裂隙中加入30μl的一種待測菌株的β－內酰胺酶粗提物。35℃培養24h，觀察裂隙的內測端（頭孢西丁紙片的抑菌環內）周圍有無細菌生長。判斷標準：裂隙的內測端周圍有細菌生長、導致頭孢西丁紙片的抑菌環有缺失者為陽性。

1.6 ESBLs表型檢測 按2010年CLSI推薦的紙片擴散法ESBLs實驗指南進行，以肺炎克雷伯菌ATCC700603為質控菌株跟隨試驗。初篩法：0.5麥氏濁度菌液均勻涂抹于MH平板，貼上紙片頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、氨曲南，于35℃溫箱中放置18－24h后觀察結果。當受試菌對頭孢他啶（30μg／片）紙片的抑菌環直徑≤22mm、氨曲南（30 μg／片）紙片的抑菌環直徑≤27mm、頭孢噻肟 （30 μg／片）紙片的抑菌環直徑 ≤27mm或頭孢曲松（30 μg／片）紙片的抑菌環直徑≤25mm，只要有一種可視為疑產ESBLs菌株。

確證法：對初篩陽性菌株，采用頭孢他啶（30 μg／片）、頭孢他啶／克拉維酸（30μg／10μg／片）、頭孢噻肟（30μg／片）、頭孢噻肟／克拉維酸（30μg／10 μg／片）檢測，一對紙片間相距2 5mm，于35℃溫箱中放置18－24h后觀察結果。任一組藥物的抑菌環直徑相差≥5mm，判定為ESBLs陽性菌株。

1.7 紙片協同試驗檢測金屬酶 0.5麥氏單位待測菌菌液均勻涂布MH瓊脂平板，中間貼10μg亞胺培南和30μg頭孢他啶紙片，距紙片1.5－2.5cm處貼一空白紙片，加2－3μl 2－巰基乙醇原液。35℃培養過夜，如靠近2－巰基乙醇側亞胺培南和頭孢他啶抑菌環有擴大者為產金屬酶菌株。

1.8 PCR擴增目的基因 用加熱裂解法制備DNA模板。反應體系總體積20μl，其中正反引物各1μl，10×PCR緩沖液2μl，dNTP及Taq酶各1 μl，DNA模板2μl。反應條件為除退火溫度不同外，95℃預變性3min，95℃30s，56℃35s，72℃45s，30個循環，72℃延伸10min。擴增產物送上海英俊生物公司測序，結果在GenBank中經BLAST分析以確定其基因型別。

1.9 統計學處理 采用 WHONET5.0軟件進行統計分析革蘭陰性桿菌的耐藥率。

2 結果

2.1 β－內酰胺酶表型檢出率 革蘭陰性桿菌β－內酰胺酶的總檢出率為24.28%（42／173），主要由單產ESBLs引起，檢出率為13.29%；其次為產ESBLs＋AmpC引起，檢出率為6.36%，見表2。

表2 42株革蘭陰性桿菌株產β－內酰胺酶表型檢出率（%）

2.2 β－內酰胺酶基因型檢出率 革蘭陰性桿菌β－內酰胺酶基因的總檢出率為24.86%（43／173），TEM、SHV、CTX－M－G1、PSE、ACT－1、DHA－1、CMY及IMP－1總陽性率在臨床分離的革蘭陰性桿菌中分別為：24.86%、8.09%、11.56%、1.16%、2.89%、5.20%、4.62%及0.58%。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單孢菌、鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌、洋蔥假單胞菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、摩根摩根菌都攜帶5－7種β－內酰胺酶基因，見表3。

表3 β－內酰胺酶在革蘭陰性菌屬中基因型的分布

2.3 基因元件在革蘭氏陰性菌屬中的分布 整合子、插入序列ISEcp1B和轉座子tnpU在173株革蘭氏陰性菌屬中檢出率分別為28.32%，16.76%，16.18%，在各菌屬中的分布見表4，基因元件陽性的菌株大多數β－內酰胺酶表型為陽性。

2.4 β－內酰胺酶陽性與陰性菌株藥敏結果比較從173株革蘭陰性桿菌藥敏結果中，42株β－內酰胺酶陽性菌株對氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑啉均耐藥；對丁胺卡那霉素、亞胺培南敏感率最高，見表5。42株β－內酰胺酶陽性菌株對抗生素的耐藥性顯著高于陰性菌株，P＜0.05。

表4 基因元件在革蘭陰性菌屬中的分布（株）

表5 β－內酰胺酶陽性和陰性菌株對15種抗菌藥物敏感率的比較

3 討論

臨床上ESBLs、AmpC酶最為常見，這與本研究表2中β－內酰胺酶表型和表3中β－內酰胺酶基因分型結果相符。產β－內酰胺酶多重耐藥革蘭陰性桿菌基因的總檢出率為24.86%，略低于表型試驗24.28%，其中有3株菌檢出β－內酰胺酶基因，但表型為陰性；有2株菌的β－內酰胺酶表型為陽性，但實驗所檢的基因都為陰性。可能是設計引物不能測出菌株攜帶的基因型，或者菌株雖攜帶基因但不表達β－內酰胺酶。研究結果顯示，所分離出的革蘭陰性桿菌中，產β－內酰胺酶最常見的菌種是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單孢菌及鮑曼不動桿菌。其他革蘭陰性桿菌如陰溝腸桿菌、洋蔥假單胞菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、摩根摩根菌也檢出β－內酰胺酶，說明攜帶β－內酰胺酶耐藥的基因在不同種類的菌屬中進行了廣泛轉移。本研究中的產β－內酰胺酶的菌株對許多β－內酰胺類的抗菌藥物以及其他抗菌藥物呈多重耐藥，給臨床抗感染構成嚴重威脅，其中對氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑啉均耐藥，對丁胺卡那霉素、亞胺培南敏感率最高，對抗生素的耐藥性顯著高于不產酶菌株。

近年來通過對β－內酰胺酶周圍的“基因環境”進行研究發現：質粒攜帶的β－內酰胺酶耐藥基因在質粒間及質粒與染色體間轉移主要是通過轉座子或插入序列為工具實現的。質粒通過接合作用、整合子通過整合酶俘獲耐藥基因，通過共用的啟動子進行表達的研究已有大量的報道［3，4］。本研究中基因元件陽性的菌株大多數β－內酰胺酶表型為陽性，大量文獻也報道基因元件可介導病原菌各種耐藥基因［5］，獲得基因元件的病原菌可表現為多重耐藥。這也是本研究中的產β－內酰胺酶的菌株對抗生素的耐藥性顯著高于不產酶菌株的另一個原因。整合子是可移動的基因元件，可攜帶多種內酰胺酶和氨基糖苷類修飾酶基因，在同種和不同種細菌中進行基因的水平轉移，從而使細菌的耐藥性得以快速傳播。本研究檢測的是Ⅰ類整合子，在大多數革蘭陰性桿菌中均可檢出，與文獻報道的有所不同［6］，這可能與研究的菌株數量和種屬不同有關。插入序列ISEcp1B長度1，655bp，其轉座酶能夠識別反向重復序列，并催化轉座因子發生刪除作用。文獻報道［7，8］在CTX－M基因的側翼發現有插入序列ISEcplB，參與耐藥基因從染色體到質粒的播散。本研究對ISEcp1BPCR產物進行測序，發現大部分ISEcp1B的右端均連接一個反向重復序列，為轉位酶提供作用位點，下游均連接CTX－M型ESBLs基因，為其水平轉移提供作用識別位點；并提供－35及－10兩個啟動子，對下游CTX－M型ESBLs的高水平表達和傳播起重要的調控作用。轉座子是指能將自身插入基因組中一個在序列上無關的新位點的DNA序列，位于β－內酰胺酶基因的兩側，很容易攜帶著抗生素抗性基因從細菌染色體轉移到質粒或噬菌體基因組上，使細菌基因具有重組和重排的潛力。本研究的革蘭陰性菌其tnpU基因陽性檢出率為16.18%，較其它文獻報道率低［9，10］。可能是由于感染菌株及細菌的耐藥特性各不相同有關。轉座子tnpU基因在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌中均有檢出，在非發酵菌中的檢出率相對較高。基因元件整合子、插入序列和轉座子基因元件廣泛分布于革蘭陰性桿菌中，其俘獲及啟動β－內酰胺酶表達的能力，可能在多重耐藥機制中起重要作用。

［1］Marie－F L，Laurent P，Daniel A，et al.In Vitro Analysis of ISEcp1B－mediated Mobilization of Naturally Occurring Lactamase Gene blaCTX－M ofKluyveraascorbata.Antimicroblal A－gents and Chemotherapy［J］.2006，50（4）：1282.

［2］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antmicrobial susceptibility testing；twentieth informational supplement M100－S20.Clinical and Laboratory Standards Institute，2010.

［3］張永標，張扣興，唐英春，等.產質粒介導的AmpC酶和ESBLs細菌的耐藥性及β－內酰胺酶基因型研究［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2004，24（7）：577.

［4］李心暉，石 壘，楊維青，等.三類整合酶基因（intI）的簡并引物PCR方法建立及應用［J］.中國微生物學和免疫學雜志，2005，25（2）：156.

［5］糜祖煌，秦 玲.多藥耐藥鮑氏不動桿菌5類抗菌藥物耐藥機制研究［J］.中華醫院感染學雜志，2008，18（7）：901.

［6］Flutt AG，Schmitz FJ.Resistance integrons and super－integrons［J］.Clin Microbiol Infect，2004，10（4）：272.

［7］Ho PL，Shek RH，Chow KH，et al.Detection and characterization of extended－spectrum beta－lactamases among bloodstream isolates of Enterobacter spp.in Hong Kong，2000－2002［J］.J Antimicrob Chemother.2005，55（3）：326－332.

［8］Marie－F L，Laurent P，DanieA，et al.In Vitro Analysis of ISEcp1B－Mediated Mobilization of Naturally Occurring －Lactamase Gene blaCTX－M ofKluyveraascorbata［J］.Antimicroblal Agents and Chemotherapy，2006，50（40）：1282.

［9］林 寧，孫海平.多藥耐藥大腸埃希菌整合子、轉座子遺傳標志研究［J］.中華醫院感染學雜志，2008，18（10）：1361.

［10］朱健銘，王建敏，姜如金，等.鮑曼不動桿菌多重耐藥及轉座子Tn1548攜帶頻率的研究［J］.中國人獸共患病學報，2009，25（1）：95.