干擾DNA－PK和CHK1表達對卵巢癌細胞輻射凋亡影響的研究

廖 琪，崔滿華

（1.大慶龍南醫院，黑龍江 大慶163453；2.吉林大學第二醫院 婦產科，吉林 長春130041）

卵巢癌是威脅女性健康最常見的惡性腫瘤之一［1］，由于發病隱匿，早期癥狀不明顯而致診斷困難，發現時多已有廣泛的盆腹腔轉移。其病死率最高，且發病率呈逐年上升的趨勢。本研究以shRNA干擾DNA－PK和CHK1在卵巢癌Skov3細胞中的表達，觀察給予輻射后細胞凋亡變化情況，探討相關輻射損傷機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

Skov3細胞用含10%小牛血清的DMEM培養基培養，青霉素100U／ml，鏈霉素100μg／ml，置于5%CO2培養箱中。轉染前一天，以3×105個細胞／孔接種于6孔培養板。

1.2 載體構建和篩選

根據DNA－PK和CHK1基因構建4個shRNA載體，并以無關序列 GTTCTCCGAACGTGTCACGT構建對照載體shNC。經限制性內切酶和測序鑒定，轉染Skov3細胞篩選出有效shRNA載體，其靶向序列分別是GGAATAGTACTTACTGCAATG、GCATTGGAATTATCTCAAAGC。將有效的shRNA載體以脂質體Lipofectimines 2000介導轉染細胞，質粒、脂質體的比例為2μg∶5μl。

1.3 照射條件及流式檢測

轉染shRNA后20h，Skov3細胞接受X－射線照射。照射采用飛利浦深部X－線治療機，電壓200 kV，電流10mA，過濾器銅0.5mm，鋁1.0mm；劑量率0.287Gy／min，總量為2Gy。X－射線照射前用PBS洗細胞，加2ml PBS后進行照射；照射后，立即更換新鮮的完全培養基，即轉染后24h或48h收集細胞，PBS洗3次，每次離心800rpm，5min。加AnnexinV／PI染色10min，PBS洗3次。應用BD FACSCalibur流式細胞儀檢測、分析細胞凋亡，應用Modifit軟件進行統計。

1.4 統計學方法

應用SPSS14軟件進行統計分析，平均值±標準差（±s）的比較采用t檢驗，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

X 射線照射后4hr，轉染 DNA－PK shRNA－5297和CHK1shRNA－617的Skov3細胞凋亡百分數為24.80%±3.20%，顯著高于單純轉染DNAPK shRNA－5297 ＋ CHK1shRNA－617 組 （t＝4.7365，P＝0.0008），顯著高于轉染shNC＋radiation組（t＝5.9663，P＝0.0001），顯著高于 Control組、shNC組、radiation組（t＝18.6358，t＝9.6229，t＝16.9786，P＜0.001）。X射線照射后28hr時，轉染 DNA－PK shRNA－5297和CHK1shRNA－617的Skov3細胞凋亡百分數為18.91%±2.81%，顯著高于單純轉染 DNA－PK shRNA－5297 ＋CHK1shRNA－617組（t＝4.1306，P＝0.0020），明顯高于轉染shNC＋radiation組（t＝6.0371，P＝0.0001），顯著高于 Control組、shNC 組、radiation組（t＝15.9068，t＝9.7317，t＝15.5251，P＜0.001）。見表1。

表1 X射線照射對轉染DNA－PK shRNA－5297和CHK1 shRNA－617的Skov3細胞凋亡影響

3 討論

DNA損傷應答（DNA damage response，DDR）是一個異常復雜的調控系統，是細胞內一種非常保守的抵御外界及內在因素誘導的DNA損傷的機制，對腫瘤的發生、發展及治療具有重要的作用。

DNA 依賴的蛋白激酶（DNA－dependent protein kinase，DNA－PK）是完成非同源末端連接DNA雙鏈斷裂修復途徑的關鍵酶，同時參與DNA復制的調控、作為轉錄因子調節基因的表達、維持染色體端粒結構的穩定、參與細胞的凋亡等諸多作用。DNA－PK由兩個調節亞基 Ku70、Ku80和一個DNA依賴的蛋白激酶催化亞單位（DNA－dependent protein kinase catalytic subunit，DNA－PKcs）組成。當發生DNA雙鏈斷裂后，DNK－PKcs在Ser2056和Thr2609殘基自磷酸化后，離開Ku而與γH2AX和53BP1共同結合在DNA雙鏈斷裂處［2］。Ku70和Ku80識別并結合于每一條DNA鏈斷端，Ku蛋白本身具有的解螺旋酶活性使兩個斷端局部發生解鏈，并可以保護游離的DNA末端避免被核酸酶分解，形成的Ku－DNA復合物吸引DNA－PKcs等到損傷部位完成結合并被激活，將兩個DNA斷端直接連接，完成修復后DNA－PK即發生自身磷酸化，DNA－PK復合體從DNA鏈上解離［3］。對于不能修復的DNA損傷或者端粒變短，DNA－PK可誘導細胞進入凋亡程序［4］。

檢查點激酶1（checkpoint kinase，CHK1）是一種高度保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白質激酶，是非常重要的細胞周期檢查點激酶。CHK1基因位于染色體11q24，其cDNA全長1891bp，編碼由476個氨基酸組成的蛋白，分子量54kD，其蛋白在多種組織均有表達，在胞漿和胞核均有表達，但主要在細胞核內發揮作用。CHK1的活性結構域包括兩個亞結構域：含有88個氨基酸殘基以β折疊構成N端結構域和210個氨基酸殘基以α螺旋結構組成C端結構域。活性位點位于這兩個亞結構域的連接區上［5］。DNA受損后活化CHK1，致使細胞阻滯在S期、G2／M期檢查點，使受損的DNA得以修復，從而維持基因組的完整性；若損傷廣泛而無法修復時則會誘導凋亡。CHK1還參與染色質和紡錘體裝配。有研究提示，多種腫瘤組織及細胞系中CHK1高表達，與腫瘤的耐藥及不良預后有關。

本研究提示DNA－PK和CHK1參與DNA損傷修復過程，包括識別DNA損傷位點，啟動修復程序，調控轉錄和凋亡。因此，應用shRNA技術沉默Skov3細胞中DNA－PK和CHK1的表達，可以明顯提高卵巢癌細胞對輻射的敏感性，不僅對相關輻射損傷機制進行了初步探討還為卵巢癌的治療提供了新方向。

［1］Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010［J］.CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277.

［2］Yang J，Yu Y，Hamrick HE，Duerksen－Hughes PJ.ATM，ATR and DNA－PK：initiators of the cellular genotoxic stress responses［J］.Carcinogenesis，2003，24（10）：1571.

［3］Collis SJ，DeWeeseTL，JeggoPA，etal.The life and death ofDNAPK［J］.Oncogene，2005，24（6）：949.

［4］Mi J，Dziegielewski J，Bolesta E，etal.Activation ofDNA－PK by ionizing radiation Is mediated by protein phosphatase 6［J］.Plos One，2009，4（2）：4395.

［5］Zhao B，Bower MJ，McDevitt PJ，et al.Structural basis for Chkl inhibition by UCN－01.J Biol Chem，2002，277（48）：46609－46615.