測量小鼠眼內壓實驗動物模型的建立

劉海鵬，宋憶淑，邵 英，張 舵＊

（1.吉林大學第一醫院 整形外科，吉林 長春130021；2.吉林大學第二醫院 眼科，吉林 長春130041）

隨著功能基因組學研究的深入，在活體動物模型上驗證基因的生理功能，有十分重要的意義。活體小鼠眼內壓測量及相關房水動力學實驗模型的建立始終是眼科領域最為困難的課題之一，測量分析小鼠眼房水靜態和動態生理學特性，該項研究工作極具挑戰性，以往很少有人涉足，如能建立一種精確性高、穩定性和可重復性好的小鼠眼內壓測量系統將可能為致盲率最高的眼科疾病青光眼的治療帶來希望［1］。為此，本研究中我們采用纖維玻璃管侵入方法，利用將液體的壓力變化經傳感器在電子計算機中轉變成數字信號的實驗原理，成功建立了獨特的活體小鼠眼內壓測量模型和與之相匹配的測量精度檢驗校正系統。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

顯微操作用玻璃管、硬硅膠管、眼科顯微手術器械、水柱壓力計；克他命（Ketamine）、甲苯噻嗪（Xylazine）、0.5%丙美卡因（Proparacaine）、垂直型玻璃拉管機（Model 700C，David Kopf Instruments）、水平顯微熱加工機（Microforge，Model MF900，Narishige Co.Japan）、旋轉式顯微磨光機 （Model BV10，Sutter Instruments Co.）、手術顯微鏡（Zeiss）、壓力傳感器（MX860，Medex Inc.）、電腦檢測系統的硬件和軟件（Model MP100，Biopac）、玻璃顯微注射器（10μl，Hamilton）、自動注射泵（Harvard Apparatus），4－軸顯微操作儀（Narishige）、電離子滲透儀、Z－軸掃描共聚焦顯微鏡（改裝）。

1.2 實驗動物

4種 CD1小鼠：wildtype；AQP1－／－；AQP4－／－；AQP1－／－＋AQP4－／－，每種10只，雌雄各半，年齡為4－6周（重量27－33克），由美國加州大學舊金山醫學院動物室提供，用含有4%脂肪的標準鼠食，室內燈光為12h光照／12h黑暗周期循環，整個實驗過程完全符合實驗動物應用法規。

1.3 眼內壓測量系統的建立和調試

利用將液體的壓力變化經傳感器在電子計算機中轉變成數字信號的實驗原理，建立眼內壓測量系統，如圖1。該系統可選擇性連接一只玻璃顯微注射器，由自動注射泵控制注入速度。測量系統的連接管各連接處緊密連接，確保無滲漏，細致檢查排出系統液體中的任何微小氣泡。驗證測量系統無滲漏：向測量系統內注入液體，使壓力升至60 cmH2O，停止注入液體，12h后壓力仍保持在60 cmH2O無下降，證明該測量系統無滲漏；驗證測量系統的精確性：先常規校正電腦檢測系統，然后在大氣壓下，將顯微玻璃管尖置于水滴中，此時大氣壓力測量值為零，將管尖刺入與水柱壓力計相連的膠皮囊，可獲得水柱壓力值，計算機記錄的測量結果與水柱壓力計數值相同，當水柱壓力改變時，微機記錄顯示出相同的改變，證明測量系統準確無誤，如圖2。

1.4 實驗小鼠準備

小鼠首先用克他命（100mg／kg）和甲苯噻嗪（9 mg／kg）混合腹腔內注射麻醉。角膜用0.5%丙美卡因（Proparacaine）滴眼表面麻醉。麻醉生效后，將小鼠固定于立體固定器，并置于加熱墊上。用肛門體溫探測器測量體溫，使小鼠體溫維持在37±1℃。鼠眼暴露于手術顯微鏡下，間斷點滴生理鹽水預防角膜干燥，如圖3。

1.5 眼內壓模型的建立

在小鼠角膜上滴一滴生理鹽水，調節4－軸顯微操作儀，使顯微玻璃管與眼球垂直軸成45－60°角，當管尖進入角膜表面鹽水中時，計算機開始測量記錄，將此時測量的大氣壓力設定為0cmH2O。在40倍手術顯微鏡下，左手持小鑷子輕輕固定眼球中后部，右手調節顯微控制器，在位于角膜正中央外側約0.2mm處，用玻璃管尖快速刺穿角膜，控制管尖恰好位于前房間隙中，不能觸及晶體囊膜及虹膜。將最初10－30秒鐘內眼內壓記錄的平均值，視為該鼠的生理眼內壓的數值。測量過程中保持角膜上的液滴，預防角膜干燥。

1.6 觀察指標 ①小鼠眼內壓測量系統精確性驗證：（1）為確認管尖無阻塞并測量到前房的真實壓力，在實驗中將第2支顯微玻璃管同時刺入前房中，并同一個水壓力計相連，如（圖1，左側灰線部分），用來驗證是否測量到前房的真正壓力，當改變水壓力計設定的壓力時，計算機可精確記錄到相應變化。（2）連續測量眼內壓30min以上，獲得穩定眼內壓，證明測量系統精確穩定無滲漏。（3）分別測量同一只小鼠雙眼的眼內壓，雙眼檢測結果相符，進一步證明測量系統是可靠的。②利用建立的眼內壓測量系統測量40只不同基因型小鼠的眼內壓。

圖1 眼內壓測量系統工作原理示意圖

圖2 小鼠眼房水動力學檢測系統精確性校正

圖3 小鼠眼房水動力學測量 顯微操作

2 結果

2.1 小鼠眼內壓測量系統精確性評價

為確認管尖無阻塞并測量到前房的真實壓力，第2支顯微玻璃管同時刺入前房中，并同一個水壓力計相連，先將壓力計壓力定為0cmH2O，后每間隔一分鐘左右，調節壓力計依次升高5cmH2O，壓力依次改變為0－5－10－15－20－25－30 cmH2O；再調節壓力計依次下降5cmH2O，壓力依次改變為：30－25－20－15－10－5－0cmH2O。此時測量系統可精確記錄到相應壓力變化，證明測量系統的精確和可信，如圖4。連續測量眼內壓30 min以上，獲得穩定眼內壓，證明測量系統精確穩定無滲漏，如圖5。分別測量同一只小鼠雙眼的眼內壓，雙眼檢測結果相符，進一步證明測量系統是可靠的，如圖6。

2.2 小鼠眼內壓測量結果

在實驗中連續記錄了40只小鼠眼內壓的生理曲線，曲線平穩不變，如圖7。

圖4 驗證測量系統精確性壓力曲線

圖5 小鼠眼內壓連續測量記錄穩定性曲線

圖6 小鼠雙眼眼內壓測量 曲線

圖7 CD1（wildtype；AQP1－／－；AQP4－／－；AQP1－／－＋AQP4－／－）小鼠眼內壓測量曲線

3 討論

目前，世界上關于小鼠眼生理指標和特性的研究資料甚少，最主要原因是動物模型建立難度大、精度要求高。小鼠眼生理測量系統的建立和調試過程是艱難和復雜的，手工操作步驟及其影響因素過多，存在著諸多系統誤差和人為誤差。這也給活體小鼠眼內壓測量及相關房水動力學研究帶來了很大困難。

以往世界上僅有3個實驗室能夠測量到小鼠眼內壓，然而這3個實驗室所采用的測量方法完全不同，因此獲得的數據自然也缺少可信性［2－3］。Jone等人的方法最初所測得的小鼠眼內壓數值偏低［4－9］，且前后波動過大。Cohan等人的非入侵法，測得的眼內壓值也相對較低，誤差較大。Avila［10］等提出的SNMS方法，雖然測量到與其它方法相比相對較高，看似相對合理的眼內壓值，但這可能與單獨用克他命麻醉劑使眼內壓升高有關。

本研究中，我們以醫學和生物物理學的理論為依據，憑借多年積累的顯微操作實踐經驗，精心設計并建立了獨特的小鼠眼內壓測量系統和與之匹配的測量精度檢驗校正系統。我們著重解決了實驗操作過程中所涉及的各種影響因素，通過將50μm的玻璃管尖刺入前房中，能記錄到瞬時眼內壓的變化情況；能在無房水滲漏的情況下，連續測量30分鐘以上眼內壓的動態變化；并能將液體注入房水間隙，同時測量房水排出、房水間隙的順應性等其它重要眼生理學指標，因此是一種精確、穩定的多功能小鼠眼內壓測量方法。

［1］Nissirios N，Goldblum D，Rohrer K，et al.Noninvasive Determination of Intraocular Pressure（IOP）in Nonsedated Mice of 5Different Inbred Strains［J］.Glaucoma，2007，16（1）：57.

［2］Avila MY，CarréDA，Stone RA，et al.Reliable measurement of mouse intraocular pressure by a servo－null micropipette system［J］.Invest Ophthal Vis Sci，2001，42：1841.

［3］Savinova OV，Sugiyama F，Martin JE，et al.Intraocular pressure in genetically distinct mice：an update and strain survey［J］.BMC Genet，2001，2：12.

［4］John SWM，JR Hagaman，TE MacTaggart，et al.Intraocular pressure in inbred mouse strains.Invest［J］.Opthalmol Vis Sci，1997，38：249.

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［6］Ahmed E，Ma J，Rigas I，et al.Non－invasive tonometry in the mouse.Invest［J］.Ophthalmol Vis Sci，2003，44：E.

［7］Danias J，Kontiola AI，Filippopoulos T，et al.Method for the noninvasive measurement of intraocular pressure in mice［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44：1138.

［8］Reitsamer HA，Kiel JW，Harrison JM，et al.Tonopen measurement of intraocular pressure in mice［J］.Exp Eye Res，2004，78：799.

［9］Ji J，Chang P，Pennesi ME，et al.Effects of elevated intraocular pressure on mouse retinal ganglion cells［J］.Vis Res，2005，45：169.

［10］Avila MY，CarréDA，Stone RA，et al.Reliable measurement of mouse intraocular pressure by a servo－null micropipette system.Invest［J］.Ophthal Vis Sci，2007，42：1841.