Rac1和Cdc42在鼻咽癌組織中的表達及預后相關性研究

齊 巖，黃 波，司晉源，張名霞，張秋航＊

（1.首都醫科大學宣武醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，北京100053；2.廣西壯族自治區人民醫院 鼻咽癌研究所）

近年來的研究顯示小G蛋白可能是細胞信號轉導的關鍵環節。有學者發現Rac1和Cdc42的定位隨著細胞不斷移動而發生改變，提示了Rac1和Cdc42與腫瘤細胞的轉移可能相關。Itoh等研究指出Rac1具有調節細胞骨架、片層偽足和細胞膜皺褶形成的功能，而這些改變是腫瘤細胞發生侵襲和轉移的早期事件[1]。本研究通過觀察鼻咽癌組織中Rac1及Cdc42的表達，探討Rac1和Cdc42信號分子可能參與鼻咽癌侵襲轉移過程的機制，本實驗采用免疫組織化學S－P法檢測鼻咽癌標本腫瘤組織與鼻咽正常上皮組織中Rac1和Cdc42的表達，并探討其表達與臨床指標的關系，以及各分子標志物之間的相互關系及其在鼻咽癌侵襲轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所有組織標本均來自2003年9月至2004年9月于廣西壯族自治區人民醫院耳鼻喉頭頸外科二區門診就診的病人，共102例，所有患者初診時經病理組織學檢查確診。按1991年WHO分類法分為低分化鱗癌和未分化非角化型癌。均未經治療。20例對照組為門診要求體檢的正常人群鼻咽部活檢組織，病理診斷均鼻咽正常上皮組織。經廣西壯族自治區人民醫院倫理委員會通過，所有參與實驗的患者均簽署知情同意書。組織標本活檢后生理鹽水沖洗潔凈，置于10%中性福爾馬林液中固定用于免疫組化。

全部患者治療后第一年內每隔3個月、第2－3年每隔6個月、3年以后每年復查一次；隨訪包括鼻內鏡、胸片、B超、CT、MRI等相關檢查。采用門診復查、信訪或電話隨訪，全部患者至少隨訪5年以上，末次隨訪時間為2009年3月，其中4例失訪，隨訪率為96.1%，失訪者按死亡處理。獲得患者的臨床資料包括病史、體格檢查、病理檢查、CT、骨掃描、超聲檢查、MRI檢查以確定其臨床分期。102例患者中，男性患者76例，女性26例，年齡在20到84歲之間。根據1998年AJCC標準，Ⅱ期患者25例，Ⅲ期患者58例，Ⅳ期患者19例，詳見表3。

102例鼻咽癌患者均予以根治性放療，Ⅲ期和Ⅳ期患者聯合化療（MEPFL方案）。采用6MV－X線常規分割照射，每次DT2Gy，每天一次，每周5次。鼻咽部原發病灶設雙側面頸聯合野，放療至DT34－40Gy后縮野改為耳前野繼續外照射至DT60－70Gy，6－8周完成。頸部設頸前切線野，無頸淋巴結轉移灶則外照射至DT50Gy，5周完成，有頸淋巴結轉移灶則外照射至DT60－70Gy，6－8周完成。脊髓和腦干劑量控制在以40Gy以下。

1.2 檢測方法 采用免疫組化SP法檢測，抗體為Rac1鼠抗人單克隆抗體（Abcam公司ab－33186美國）和CDC42鼠抗人單克隆抗體（Santa CruzSC－872美國）。免疫組化結果判斷標準參照陳豐霖等的方法：采用雙盲法，觀察切片至少5個以上具有代表性的高倍視野，不少于1000個細胞，對免疫組化結果進行評估[2]。

1.3 統計學處理 應用SPSS11.0分析軟件，免疫組化的數據采用χ2檢驗及四格表確切概率法。相關性Spearman等級相關分析。

生存時間按月計算。主要應用了Kaplan－Meier統計方法，將Rac1和Cdc42免疫組化蛋白表達的量值按（－）和（＋）為低表達組，（＋＋）和（＋＋＋）為高表達組進行分組，分別計算了總生存概率及無瘤生存率。組間比較應用了Log－rank方法進行顯著性檢驗及趨勢檢驗。P＜0.05具有顯著的統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色顯示 SP法免疫組化切片染色背景清晰，陰性對照無著色。Rac1陽性反應，主要存在于細胞漿和細胞核中，呈棕黃色顆粒。Cdc42陽性反應主要存在于細胞漿，呈棕黃色，見圖1。

2.2 102例鼻咽癌中，Rac1陽性表達86例（84%），染色呈棕褐色彌漫性分布。陰性表達16例（16%），28例（27%）弱陽性表達，58例（57%）強陽性表達。而Cdc42陽性表達83例（81%），染色呈棕褐色彌漫性分布。陰性表達19例（19%），25例（25%）弱陽性表達，58例（57%）強陽性表達，見表1、2，圖1。

圖1 Rac1和Cdc42在鼻咽癌組織及鼻咽部正常上皮組織中中的表達

表1 鼻咽癌組織和鼻咽部正常上皮組織中Rac1的表達

表2 鼻咽癌組織和鼻咽部正常上皮組織中Cdc42的表達

2.3 分析發現Rac1和Cdc42表達鼻咽癌與對照組相比有顯著差異，對照組Rac1和Cdc42表達均顯著低于鼻咽癌組，兩者差異有統計學意義（P＝0.004；P＝0.016）。

2.4 鼻咽癌中Rac1和Cdc42表達與臨床病理的關系 表3結合患者的臨床資料，反映Racl和Cdc42表達率的臨床意義。我們看到Rac1和Cdc42表達率與患者的年齡、性別均無關，而在分化程度、浸潤深度和TNM分期等臨床病理指標之間的差異比較則顯示統計學意義非常顯著。

表3 鼻咽癌中Rac1和Cdc42表達與臨床病理的關系

2.5 鼻咽癌Racl和Cdc42表達水平與臨床TNM分期的關系 TNM分期是臨床指示腫瘤嚴重程度的量化指標。分析Racl和Cdc42陽性表達的癌組織不同TNM分期的Rac1和Cdc42表達水平，可以發現Rac1和Cdc42表達水平在各分期之間存在明顯的差異，見表4、5。

表4 鼻咽癌組織中Rac1的表達水平與TNM分期的關系

2.6 鼻咽癌組織中Rac1和Cdc42表達的相關性為了進一步分析鼻咽癌組織中Rac1和Cdc42表達的關系，我們將免疫組化的數據進行了Spearson相關分析。分析其在鼻咽癌組織中的表達強度的關系，我們觀察到Rac1和Cdc42之間存在相關關系（P＜0.05），見表6。

2.7 經Kaplan－Meier計算總生存率平均為61.9±23.0，平均隨訪時間為60個月。病人的隨訪時間為12－87個月。102例患者中30例患者死于鼻咽癌。其生存時間的范圍是3－67個月。在圖2（a－d）中可以看到經Kaplan－Meier計算的Rac1和Cdc42的生存率曲線。在Rac1低表達組和高表達組中，其5年總生存率和無瘤生存率分別為88.64% 和86.36比44.83和34.48%。（χ2＝27.236，P＜0.001；χ2＝28.836，P＜0.001）。但是，Cdc42 低 表達組 和Cdc42高表達組，5年生存率的差異無統計學意義（χ2＝0.822，P＝0.364）。在這兩組中，無瘤生存率的差異也同樣無統計學意義（χ2＝0.289，P＝0.591）。

表5 鼻咽癌組織中Cdc42的表達水平與TNM分期的關系

表6 鼻咽癌組織中Cdc42和Rac1表達的關系

圖2 Kaplan－Meier計算的Rac1和Cdc42的生存率曲線

3 討論

近年來的研究結果顯示Rac1在人類的正常組織中呈現低水平表達或不表達，但在卵巢癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織或細胞中表達增高，而且Rac1的高表達同腫瘤細胞的分化程度、病理分型、TNM 分 期等表 型密切 相關[3－9]。以往有關Cdc42同惡性腫瘤的相關性研究有以下幾個方面，Cdc42在肺部腺癌中的表達明顯高于腺瘤，提示其可能與肺部腫瘤的進展有關[10]。Hirsch等報道Cdc42的負顯性突變體同大鼠乳腺癌細胞侵襲和轉移相關[11]。在2002年的Oncogene中，Meriane等指出Cdc42和Rac1與平滑肌肉瘤的惡性表型密切相關[12]。

本論文以免疫組化SP法檢測鼻咽癌組織和鼻咽部正常上皮組織中Racl和Cdc42的表達，證明在不同組織中Racl和Cdc42表達不同：鼻咽癌組織中Racl和Cdc42表達陽性率為84%和81%，而鼻咽部正常上皮組織表達陽性率為25%和35%。癌組織Racl和Cdc42的陽性率遠高于鼻咽部正常上皮組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。在臨床TNM分期上Racl和Cdc42表達不同：TNM分期越高，則Racl和Cdc42表達率也越高。從病理角度看：分化程度的相關性最大，低分化癌陽性率高達91.1%和87.8%，而高中度分化患者陽性率只有33.3%，兩組之間的差異非常明顯。可見，Racl和Cdc42的表達與鼻咽癌病情密切相關：病情越重、分化程度越低，Racl和Cdc42表達率越高。

一般認為，鼻咽癌的預后與病理類型、TNM分期等因素相關。但我們在臨床中常常見到相同分期的病人卻有種截然不同的預后病程。近年來一些實驗研究證實，有些分子標志物也被證實為有意義的預后預測因子，這些因子有些已被作為預后判斷的指標，與治療方案結合，作為輔助治療的選擇依據。

關于鼻咽癌的預后的分子標志物的研究近年來成為熱點，其中血漿EBV－DNA水平的相關研究較多，但目前大規模人群篩查指標的研究目前還難以推廣。本研究通過多因素分析，發現腫瘤的臨床分期與鼻咽癌患者預后有顯著相關性，是影響患者總體生存率和無瘤生存率的獨立因素。目前對鼻咽癌腫瘤相關標志物的研究尚處于探索性階段，鼻咽癌的生物標志物檢查將幫助我們進一步從分子生物學的角度觀察和解釋癌的臨床轉歸。然而，如何有機地綜合這些信息，對個體進行準確的預后預測，指導個體化治療方案的選擇，并最終改善預后，還需進行更深入的研究和長期的努力。

[1]Itoh RE，Kurokawa K，Ohba Y，et al.Activation of Rac and Cdc42 video imaged by fluorescent resonance energy transfer－based single－molecule probes in the membrane of living cells[J].Molecular and Cellular Biology，2002，22：6582.

[2]陳豐霖，王小眾，李建英，等.胃癌組織中cox－2與 NF－KB的表達及關系[J].臨床消化病雜志，2003，15：109.

[3]Minard ME，Kim LS，Price JE，et al.The role of the guanine nucleotide exchange factor Tiam1in cellular migration，invasion，adhesion and tumor progression[J].Breast Cancer Res Treat，2004，84：21.

[4]Fleming IN，Batty IH，Prescott AR，et al.Inositol phospholipids regulate the guanine－nucleotide－exchange factor Tiam1by facilitating its binding to the plasma membrane and regulating GDP／GTP exchange on Rac1[J].Bio Chem J，2004，382：857.

[5]Achiwa H，Lazo JS.PRL－1tyrosine phosphatase regulates c－Src levels，adherence，and invasion in human lung cancer cells[J].Cancer Research，2007，67：643.

[6]Owen D，Lowe PN，Nietlispach D，et al.Molecular dissection of the interaction between the small G proteins Rac1and RhoA and protein kinase C－related kinase 1（PRK1）[J].Journal of Biological Chemistry，2003，278：50578.

[7]Engers R，Springer E，Michiels F，et al.Rac affects invasion of human renal cell carcinomas by up－regulating tissue inhibitor of met－alloproteinases（TIMP）－1and TIMP－2expression[J].Journal of Biological Chemistry ，2001，276：41889.

[8]Malliri A，Collard JG.Role of Rho－family proteins in cell adhesion and cancer[J].Curr Opin Cell Biol，2003，15：583.

[9]Fritz G，Brachetti C，Bahlmann F，et al.Rho GTPases in human breast tumours：expression and mutation analyses and correlation with clinical parameters[J].Brit J Cancer，2002，87：635.

[10]Yao RS，Wang Y，Lubet RA，et al.Differentially expressed genes associated with mouse lung tumor progression[J].Oncogene，2002，21：5814.

[11]Hirsch DS，Shen Y，Wu WJ.Growth and motility inhibition of breast cancer cells by epidermal growth factor receptor degradation is correlated with inactivation of Cdc42[J].Cancer Research，2006，66：3523.

[12]Meriane M，Charrasse S，Comunale F，et al.Participation of small GTPases Rac1and Cdc42Hs in myoblast transformation[J].Oncogene，2002，21：2901.