腫瘤干細胞標記物LGR5和CD133在卵巢癌中的表達和意義

翟穎仙，張麗紅，周 莉，王醫術＊

（1.吉林大學 病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2.吉林大學基礎醫學院 組織學與胚胎學系，吉林 長春130021）

卵巢癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，由于缺乏有效的早期診斷方法，以及腫瘤的高復發率和復發后高耐藥性，其療效并不理想。因而早期診斷及如何解決卵巢癌的復發和耐藥性問題，成為提高卵巢癌患者存活率的關鍵。

腫瘤干細胞（Cancer Stem Cell，CSC）具有無限增殖潛能，對腫瘤的發生、發展和轉移起決定性作用，也是腫瘤復發、轉移和治療失敗的根源。而卵巢癌干細胞的表面標記物的選擇，則成為早期診斷及攻克腫瘤的前提。目前關于卵巢癌干細胞的研究較少，尚未發現特異性的卵巢癌干細胞標志物。由于CSC與正常干細胞具有相似的表面標志，因此CSC標志物的篩選可參考正常干細胞標志物，如CD133等。而Lgr5與結腸癌等原發性腫瘤之間存在著密切聯系，有可能成為今后臨床腫瘤靶向治療的關鍵點。

本研究通過以33例卵巢漿液性乳頭狀腺癌為研究對象，以6例相對正常卵巢組織，6例卵巢漿液性囊腺瘤作為對照，通過免疫組織化學方法觀察干細胞標記物Lgr5和CD133的表達情況，并探討二者表達的相關性，為以腫瘤干細胞為靶向治療卵巢癌提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗組織標本來源 標本來源于吉林大學第一臨床醫院2008年7月—2009年12月期間的卵巢切除標本，共計45例。包括：相對正常卵巢組織6例；卵巢漿液性囊腺瘤6例；卵巢漿液性乳頭狀腺癌33例。所有患者術前均未接受任何化療、放療等的輔助治療，臨床病例資料完整。

1.2 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色采用SP法。

1.3 結果判定 高倍鏡下（200×）每張切片隨機選擇5個視野，正常卵巢組織計數卵巢表面上皮細胞，卵巢漿液性囊腺瘤和卵巢漿液性乳頭狀腺癌計數腫瘤細胞，每個視野計數200個細胞，共1000個，計算陽性細胞所占的百分數，按如下分級：＞50%為＋＋＋（陽性）；25%－50%為＋＋；＜25%為＋；無著色為 －（陰性）。

1.4 統計學方法 全部實驗數據用SPSS17.0統計軟件分析處理。各組間數據分別采用χ2檢驗，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 Lgr5在正常卵巢、漿液性囊腺瘤和漿液性乳頭狀腺癌中的表達 Lgr5主要表達于細胞質中，呈棕黃色顆狀。Lgr5蛋白在正常卵巢組織中的陽性表達率為33.3%（2／6），且均為弱陽性表達；在卵巢漿液性囊腺瘤中陽性表達率也為33.3%（2／6），與正常卵巢組織相比無差異（P＞0.05）。在卵巢漿液性乳頭狀腺癌組織中，Lgr5陽性表達率為78.7%（26／33），與正常卵巢組織和漿液性囊腺瘤相比，有顯著性差異（P＜0.05）。且隨著腫瘤分化程度的不同，從高分化到低分化，Lgr5陽性表達率逐漸提高（見表1，圖1）。

表1 Lgr5蛋白在正常卵巢、漿液性囊腺瘤和漿液性乳頭狀腺癌中的表達

圖1 Lgr5在不同分化程度的卵巢漿液性乳頭狀腺癌組織中的表達（400×）

2.2 CD133在正常卵巢、漿液性囊腺瘤和漿液性乳頭狀腺癌中的表達 CD133主要表達在細胞質中，呈棕黃色顆粒。CD133在正常卵巢組織中陽性表達率為33.3%（2／6），且為弱陽性表達。在漿液性囊腺瘤中陽性表達率為50%（3／6），與正常卵巢組織相比有顯著差異（P＜0.05），但依然為弱陽性表達。CD133在漿液性乳頭狀腺癌中陽性表達率為57.5%（19／33），與正常卵巢組織相比有顯著差異（P＜0.05），但與漿液性囊腺瘤無差異（P＞0.05）。隨著腫瘤分化程度的不同，從高分化到低分化，CD133陽性表達率逐漸增高（見表2，圖2）。

表2 CD133蛋白在正常卵巢、漿液性囊腺瘤和漿液性乳頭狀腺癌中的表達

圖2 CD133在不同分化程度的卵巢漿液性乳頭狀腺癌組織中表達（400×）

2.3 卵巢癌中Lgr5和CD133表達相關性 33例卵巢癌標本中，分析Lgr5蛋白與CD133蛋白表達水平發現，兩者均為陰性表達6例，均為陽性表達18例，Lgr5＋CD133－有8例，Lgr5－CD133＋有1例。Lgr5和CD133在卵巢癌中表達呈正相關，差異有統計學意義，r＝0.71，P＜0.01。

Lg CD133 r5﹣合計＋ ＋＋ ＋＋＋6 8 0 0 14＋ 1 5 7 0 13＋＋ 0 1 2 2 5＋＋＋ 0 0 0 1 1合計﹣7 14 9 3 33

3 討論

卵巢癌是女性高發的惡性腫瘤之一。由于缺乏有效的早期診斷方法，其5年生存率較低。近年來，隨著腫瘤干細胞學說的興起，卵巢癌干細胞學說為卵巢癌的診斷和治療提供了新的靶點。

然而，由于腫瘤干細胞膜蛋白表達譜的異常，以及在卵巢癌中正常干細胞表型相關信息的缺乏，人們只能依賴于篩查已知的與卵巢表面上皮干細胞相關的干細胞標記物來分離鑒定卵巢癌干細胞。目前，了解較多的有 CD133，Lgr5，CD44、CD117和CD44／MYD88。本實驗選取其中的Lgr5和CD133作為腫瘤干細胞標記物，觀察它們在卵巢漿液性乳頭狀腺癌中的表達情況。

富含亮氨酸重復序列G－蛋白偶聯受體5（Lgr5），又 名 GPR49、HG38、FEX、GPR67 和MGC117008，是由18個富含亮氨酸的重復單位和7個跨膜區域組成的大分子蛋白，是G－蛋白偶聯受體家族的成員之一[1]。Wnt信號轉導通路是調控人體胚胎發育和生長的重要通路，Lgr5作為 Wnt信號通路中β聯蛋白TCF－4的靶基因，其表達的上調或下調，可能在細胞的增殖、分化和腫瘤的發生、發展過程中起重要作用。因而，Lgr5蛋白也被認為是受Wnt信號途徑調節的靶基因之一。許多研究也證實Lgr5在多種腫瘤細胞中高表達，如胃癌，結腸癌以及皮膚基底細胞癌等[2－4]。

本實驗通過免疫組織化學方法，觀察Lgr5在正常卵巢組織、卵巢漿液性囊腺瘤和卵巢漿液性乳頭狀腺癌中的表達情況。結果顯示，正常卵巢組織中，Lgr5在上皮、卵泡細胞，血管壁和間質呈弱陽性表達，主要表達在細胞質中，呈棕黃色顆粒，陽性表達率為33.3%；卵巢漿液性囊腺瘤中，Lgr5表達于瘤細胞胞質中，陽性表達率為33.3%，與正常卵巢組織相比無差異性（P＞0.05）。卵巢漿液性乳頭狀腺癌中，Lgr5陽性表達在癌細胞胞質中，陽性表達率為78.7%，但表達表現不均一，即同一視野中，部分癌細胞呈強陽性表達，其中強陽性表達3例，與正常卵巢組織和漿液性囊腺瘤相比，均有顯著性差異（P＜0.05）。仔細觀察發現Lgr5在腫瘤中隨著腫瘤分化程度的不同，從高分化到低分化，Lgr5陽性表達率逐漸提高。此結果提示我們隨著腫瘤惡性程度的進展，Lgr5蛋白水平表達增高，說明Lgr5蛋白與腫瘤的發生進展有關，可能有助于卵巢癌的篩選和惡性程度的判定。

跨膜糖蛋白CD133是目前用于各種腫瘤干細胞研究的熱點標志物之一。目前我們已經知道，CD133可表達于造血定向干細胞、上皮干細胞，和包括腦、前列腺、胰腺、肝臟、皮膚、卵巢、結腸等組織在內的腫瘤干細胞[5－7]。CD133的表達與上皮性腫瘤密切相關，是干細胞和腫瘤干細胞表面特異性標記物。研究顯示，CD133可以作為腦腫瘤干細胞標記物，腦腫瘤中CD133陽性細胞具有很強的增殖、自我更新和分化能力；胰腺癌中CD133側群細胞具有更強的致瘤性，很可能是胰腺癌干細胞表面特異分子標記。同時CD133也是卵巢癌中研究的最多的標記物。報道顯示，CD133－1和CD133－2均可表達于卵巢癌中，而在正常卵巢組織，良性腫瘤和轉移癌中則未見表達[8]。CD133陽性卵巢癌細胞比CD133陰性細胞具有更高的增殖能力和克隆形成能力。此后，又有研究發現卵巢腫瘤中的CD133陽性細胞具有成瘤性，并進一步證實CD133的調節異常與腫瘤的惡性轉化相關。CD133陽性細胞具有自我更新能力，并與異種移植腫瘤侵襲性增加有關。因而，CD133可能是卵巢癌干細胞的標記物。

本研究顯示，在正常卵巢組織中，CD133陽性表達在細胞核或細胞質中，呈棕黃色顆粒，為弱陽性表達，陽性表達率為33.3%。在卵巢漿液性囊腺瘤中，CD133在瘤細胞胞質中弱陽性表達，陽性表達率為50%，與正常卵巢組織相比，有顯著差異（P＜0.05）。卵巢漿液性乳頭狀腺癌中，CD133陽性表達在癌細胞胞核或胞漿中，陽性表達率為57.5%，且在癌巢基地部位強陽性表達，與正常卵巢組織相比有顯著差異（P＜0.05），但與漿液性囊腺瘤相比無差異（P＞0.05）。仔細觀察發現隨著腫瘤分化程度的不同，從高分化到低分化，CD133陽性表達率逐漸增高。隨著腫瘤惡性程度的進展，CD133蛋白水平表達增高，與腫瘤的發生進展有關。癌巢基底部位強陽性表達則提示我們，CD133陽性細胞可能參與侵襲過程。檢測CD133在卵巢癌不同病理階段的表達，可能有助于卵巢癌的診斷及病程進展的判定。

本研究結果提示Lgr5與CD133表達呈正相關，即Lgr5亦可作為卵巢癌干細胞的備選標記物，與CD133一樣與卵巢癌的發生發展有重要關聯。至今為止，未見Lgr5和CD133在卵巢癌中表達相關性的報道。

綜上所述，本研究的結果表明Lgr5和CD133可能作為卵巢漿液性乳頭狀腺癌干細胞的表面標記物，為卵巢癌惡性程度的判定和治療提供新的靶點。

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