乙肝病毒外膜大蛋白、前S1抗原、HBV－DNA與血清標志物之間相關性分析

龔 杰，劉柏林，方艷秋＊，楊廣民

（1.廈門大學醫院 體檢科，福建 廈門361005；2.吉林省人民醫院，長春130021）

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種傳染性疾病，可進一步發展為肝硬化甚至肝癌，晚期導致患者肝功能衰竭，嚴重影響患者的健康。早期對HBV感染進行明確診斷，做出相應防治措施，對提高臨床療效和改善患者預后具有重要意義。ELISA法檢測血清學標志物（HBV－M）是確定乙肝病毒感染的傳統方法，但對評估HBV感染者病毒復制、轉歸及預后等情況有一定的局限性。HBVDNA定量檢測用于判斷病毒復制的活躍程度已廣泛應用于臨床。乙肝病毒外膜大蛋白（HBV－LP），是病毒形成完整外膜的重要標志，與病毒復制密切相關[1]。前S1抗原（Pre－S1）是 HBV 病毒前S1基因編碼的一種外膜蛋白[2]，在病毒入侵肝細胞過程中起重要作用，是HBV感染和復制的新標志。本文對864例乙型肝炎患者 HBV－LP、Pre－S1抗原、HBV－DNA載量和乙型肝炎血清標志物的檢測，探討反映不同血清學類型患者體內病毒復制及抗病毒療效監測的最佳指標以及分析各指標之間的關系，為臨床診療乙型肝炎提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集吉林省人民醫院體檢中心2009－2012年體檢人員中所有乙型肝炎感染者血清標本，其中男426例，年齡23－62歲，女438例，年齡28－68歲。患者無其它類型肝炎合并感染，診斷均符合北京第五次全國傳染病和寄生蟲病會議修訂的標準。同時以體檢中心100例單項HBsAg（＋）及HBV－M全陰性體檢者作為健康對照。

1.2 儀器與試劑 檢測儀器包括Fluido洗板機、Reader2010酶標儀、Smartcycle熒光定量PCR儀等。血清學標志物HBV－M檢測試劑購自上海科華生物工程有限公司，HBV－LP抗原、Pre－S1抗原檢測試劑和HBV－DNA定量檢測試劑均購自廈門英科新創科技有限公司。

1.3 檢測方法 HBV－M檢測采用ELISA法，目測定性檢查；HBV－LP、Pre－S1抗原采用ELISA 雙抗體夾心法檢測，嚴格按照試劑盒操作說明書進行操作，選擇波長450nm，通過酶標儀測定吸光度（A）值，按要求設定Cutoff值，測定結果大于Cutoff值為陽性。HBV－DNA檢測采用熒光定量PCR法，病毒載量以copies／ml表示，結果以5×102copies／ml為參考臨界值，大于此值為陽性。

1.4 統計學方法 所有數據輸入到Excel表中，采用SPSS18.0軟件進行統計學處理，計數資料組間差異采用χ2檢驗，計量資料組間差異采用方差分析、相關性用非參數Spearman等級相關檢驗分析，P＜0.05或P＜0.01為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同HBV－M模式中HBV－LP、Pre－S1 及HBV－DNA陽性率比較 100例健康對照組HBVLP、Pre－S1及 HBV－DNA的檢測結果均為陰性。不同 HBV－M模式中HBV－LP、Pre－S1 及 HBVDNA陽性例數及陽性率如表1所示。數據經χ2檢驗后得出：HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性模式組（大三陽）HBV－LP、Pre－S1及 HBV－DNA 陽性率顯著高于其它 HBV－M 模式組（P＜0.05），提示 HBVLP、HBV DNA與HBeAg高度相關，可以反映患者體內HBV的復制水平。

表1 不同HBV－M模式中HBV－LP、Pre－S1及HBV－DNA的檢出率比較

2.2 HBV－LP、Pre－S1與 HBV－DNA 陽性符合率比較 HBV－LP與 HBV－DNA的陽性率無顯著差異（P＞0.05），與 HBV－DNA 陽性符合率為86.9%。Pre－S1的陽性率明顯低于 HBV－LP與 HBV－DNA的陽性率（P＜0.05），與 HBV－DNA的陽性符合率為57.7%。說明HBV－LP較Pre－S1在反應病毒復制及疾病活動方面更為靈敏，HBV－LP的檢測比Pre－S1更有意義。

表2 HBV－LP、Pre－S1與 HBV－DNA陽性率比較

2.3 HBV－LP、Pre－S1與 HBV－DNA 拷貝數及 HB－sAg定量值之間的相關性比較 HBV－DNA陽性的668例標本中，HBV－DNA拷貝數與 HBV－LP、Pre－S1平均A值具有顯著的正相關性，而與HBsAg無明顯相關性（見表3）。

表3 HBV－DNA拷貝數與HBV－LP、Pre－S1及HBsAg定量值的相關性比較

3 討論

HBV血清標志物檢測是目前診斷乙型肝炎最常用的指標，它反映了人體對乙型肝炎病毒的免疫反應狀態和病程的轉化過程，也是判斷患者傳染性及預后的傳統指標。然而由于HBV血清標志物復雜多樣，臨床上難以根據這些結果對HBV感染復制情況進行準確判斷，因此它主要反映人體對乙肝病毒的免疫反應狀態，不能直接反映HBV在患者體內的復制情況。

目前臨床判斷患者病毒是否復制的常用指標是HBeAg和HBV－DNA，并發現部分HBeAg陰性患者HBV－DNA仍處于較高水平，說明患者體內依然有病毒大量復制。臨床上通常以HBeAg和HBVDNA轉陰作為抗病毒治療的終點，然而即使如此，仍有部分患者停藥后出現病情反復。HBV的S基因編碼三種外膜蛋白：主蛋白（HBsAg）、中蛋白（HBsAg和 Pre－S2蛋白）、大蛋白（HBsAg、Pre－S1蛋白和Pre－S2蛋白，HBV－LP）[3]，研究證明 HBVLP在病毒復制過程中起著關鍵作用[4]，HBV－LP診斷試劑盒的研制成功有望為填補傳統兩對半試劑的空白并彌補HBV DNA檢測的不足，成為抗病毒治療終點判定的新的指標。

在本實驗研究中共對864例乙型肝炎患者進行了 HBV－LP、Pre－S1抗原、HBV－DNA載量和乙型肝炎血清標志物的檢測。結果顯示：“大三陽”感染者中HBV－LP和HBV－DNA陽性率均較高，且顯著高于其它血清模式組，同時HBV－LP和HBV－DNA的陽性率無顯著差異。“大三陽”感染模式是病毒復制活躍，急性期、傳染性強的模式，提示 HBV－LP、HBV DNA與HBeAg高度相關，均為評價乙型肝炎傳染性及病毒復制的良好指標。在檢測結果中還發現，雖然Pre－S1與 HBV－LP、HBV DNA 具有一定的相關性，但Pre－S1的陽性率明顯低于HBV－LP與HBV－DNA的陽性率。這與Pre－S1的特殊結構以及試劑盒制備的局限性有關。Pre－S1檢測試劑使用的單抗是用化學合成的多肽而制作的，而應用該多肽無法模擬Pre－S1形成的構象表位，因而導致Pre－S1的檢出率較低[5]。最近幾年的研究采用其特異結構型表位抗體檢測HBV－LP取得了技術上的突破。本次實驗結果也表明HBV－LP比Pre－S1試劑效果大大提高，且大蛋白的檢出率與血液中病毒DNA的符合率高度符合（86.9%），可作為判斷病毒復制的一個可靠指標。

進一步的檢測及分析證實，不同HBV－DNA拷貝數與HBV－LP、Pre－S1的平均A值具有良好的相關性，且三者與HBsAg定量值均無相關性，再次說明HBsAg不能作為乙肝病毒復制及傳染性強弱的指標，而 HBV－LP、Pre－S1可以部分作為 HBV－DNA檢測的補充檢測指標。

我國衛生資源分配不一，尚有很多醫院不具備HBV－DNA PCR的實驗水平。而免疫測定技術因其有效、直接、簡便的特點，已經在臨床診斷應用上占主導地位，在我國大中小型醫院普遍應用，HBVLP檢測有利于中小型醫院也掌握血液內病毒復制指標的檢測方式。進而提高臨床醫生的診斷和治療水平。同時，HBV－LP的完全消退提示抗病毒治療較為徹底，此時選擇停止用藥可以避免患者病情的反跳。HBV－DNA與HBV－LP的聯合檢測對于臨床判斷病情、選擇最佳治療方案、檢測病情變化和觀察臨床療效具有重要的意義。

[1]Wang NY，Zhang D，Zhao W，et al.Hepatitis B virus large surface protein in serum as a candidate biomarker for evaluating hepatitis B virus infection[J].Clin Biochem，2011，44（14－15）：1199.

[2]Zhang ZH，Peng J，Xia JB，et al.S gene mutations in HBsAg／HB－sAb double positive chronic hepatitis B patients[J].Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2009，17（4）：266.

[3]Zhu X，Gong Q，Yu D，et al.Early serum hepatitis B virus large surface protein level：A stronger predictor of virological response to peginterferon alfa－2athan that to entecavir in HBeAg－positive patients with chronic hepatitis B[J].J Clin Virol，2013，57（4）：318.

[4]Wang NY，Zhang D，Ge YW，et al.Clinical significance of measuring hepatitis B virus large surface protein in serum[J].Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi，2010，24（5）：349.

[5]Le DY，Blanchet M，Sureau C.The pre－S1and antigenic loop infectivity determinants of the hepatitis B virus envelope proteins are functionally independent[J].J Virol，2009，83（23）：12443.