家族性擴張型心肌病家系基因篩查的研究

張明秋，司大勇，焦海旭，張桂華，王 娟

（1.吉林大學 中日聯誼醫院 心內科，吉林 長春130033；2.吉林大學 生命科學學院·東北亞生物演化教育部重點實驗室，吉林 長春130021）

擴張型心肌病（DCM）是以左心室擴大和收縮功能受損最終導致心力衰竭以及惡性心律失常為指征的心肌疾病。是危害人類健康的嚴重疾病之一，占所有心肌病的60%[1]。擴張型心肌病是特發性，而不是像心肌缺血、瓣膜病或者高血壓等可識別的原因導致的。目前認為家族性擴張型心肌病（FDCM）占特發性擴張型心肌病（IDC）病人數目的比例約上升至50%，而據20世紀80年代初的報道稱，FDCM 的發生率 是2%－6.5%[2－5]。家族性擴張型心肌病是擴張型心肌病沒有被認知的一部分，核纖層蛋白A／C的缺乏可能是導致擴張型心肌病最常見的原因[6]。本篇就核纖層蛋白A／C的基因LMNA有無發生突變，我們收集一個中國人擴張型心肌病的家系，用基因測序的方法對LMNA基因的12個外顯子進行基因突變篩查。初步探索該家系引起擴張型心肌病的基因突變位點。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

包含63名成員的一個擴張型心肌病伴房室傳導阻滯的家系（實際采血人數45人）。所有家系成員均按照WHO1995年制定的擴張型心肌病診斷標準（左心室射血分數＜45%，左心室舒張末期內徑＞217cm／m2或左心室舒張末期內徑＞55mm，排除其他可能引起心臟擴張的心血管疾病和全身疾病）進行體檢、心電圖、超聲心動圖等檢查。

1.2 方法

基因組DNA提取：取外周全血300μl，采用全血DNA純化系統（華美公司，洛陽）提取全血基因組DNA。PCR反應采用內含子特異性引物，以擴增LMNA基因的全部12個外顯子、外顯子－內含子連接部位，以及基因上游區域片段。所采用引物如表1所示，部分引物采用文獻報道引物[7]。PCR反應體系為50μl；Taq酶1.5U和其附帶緩沖液（寶生物公司，大連），dNTP 0.2mmol·L－1，正義和反義引物各1.5μmol·L－1，全血DNA 1μl。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離純化后，用ABI Prism 310基因測序儀測序。

2 結果

2.1 家系及先證者資料 先證者（陳××），41歲，男性，24年前出現胸悶、乏力，以活動后明顯，來我院門診，心電圖示：竇性心動過緩，最低心率36次／分，診斷為“病竇綜合征”，該患于7年前癥狀加重，在我院診斷為“擴張型心肌病”，在北京阜外醫院安裝人工心臟起搏器（單腔），ICD未安裝成功。超聲心動圖示4個腔室均擴大（左心室舒張末期內徑56.8mm，右房65mm＊83mm，右室26.4mm，左房54.2mm），室壁變薄，室壁運動彌漫性減弱。2009年3月31日以擴張型心肌病在我科住院，住院期間24小時動態心電圖檢測出短陣室速，經治療一周出院，出院后一個月猝死家中，其他家系成員見圖1。

表1 Sequence of LMNA specific primers used in PCR.

圖1 Genetic map of Family Dilated Cardiomyopathy

研究人類疾病的遺傳規律最常用的方法是系譜分析法，從先證者入手，追溯調查所有家族成員的數目、親屬關系及某種遺傳病的分析資料。不僅包括患者成員也要包括家族的正常成員。根據調查資料制成家譜圖，對全家系成員進行回顧性分析，確定遺傳因素及遺傳方式，從而對類似的擴張型心肌病具有診治的指導作用。

既往的遺傳學分析結論DCM屬于單基因遺傳病，最常見的遺傳模式是常染色體顯性遺傳，但有少量家族呈常染色體隱性遺傳、X連鎖遺傳[8]。分析我們的這個FDCM家系，有以下的特點：

（1）患者有特征表型，概括表現為DCM并傳導系統異常，晚期出現進行性心功能下降，合并各種心律失常。

（2）同一家系中有至少11名患病者。傳導異常先出現于DCM，安裝起搏器不能降低猝死發生率，安裝ICD可能起到有益作用。

（3）母親為基因攜帶者或患者，女性患者僅表現為病竇綜合征，母親所系的下代男孩大部分發病，顯性，女孩大部分不發病，如發病僅為病竇綜合征，安裝人工心臟起搏器或不安裝。

（4）發病男孩多半發病年齡在20－30歲，多數出現DCM伴病竇綜合征或三度房室傳導阻滯，需要安裝人工心臟起搏器。大多數發病年齡較大在30－40歲時容易發生猝死。從家庭成員敘述猝死情況考慮為突發室顫的可能性大。

2.2 LMNA基因測序分析 PCR擴增該家系的45名家族成員的LMNA的12個外顯子，測序證實未發現該家族有LMNA基因突變位點。部分測序圖譜參見圖2。

3 討論

擴張型心肌病（DCM）是臨床上導致心衰的主要疾病之一，病死率較高，目前尚無有效的治療手段，主要治療方法為心臟移植。我國擴張型心肌病的發病率為19／10萬[9]，20－50歲高發。其病因可為特發性、家族遺傳性、感染／病毒、酒精／中毒性等。家族性擴張型心肌病（FDCM）是指家族中有兩個或以上家族成員有特發性DCM，約占DCM的20%－50%[10]。遺傳因素在FDCM的發病中起重要作用。FDCM是由于至少40個不同的獨立基因突變導致的。通過動物實驗對其進行研究，導致心肌病的基因數目高達100多。其中核纖層蛋白基因（LMNA）是FDCM的重要致病基因[11]。據報道在FDCM中與LMNA編碼蛋白Lamin A／C突變有關的FDCM約占10%[12]。LMNA基因突變引起的FDCM具有獨特的臨床特點，大約25%的LMNA突變攜帶者早期無明顯癥狀[13]。但隨年齡的增長，LMNA突變攜帶者的外顯率增高，到60歲的突變外顯率幾乎為100%[14]。患者早期心電圖特征為低幅P波，PR間期延長，QRS波群相對正常，晚期發展為心房顫動和DCM。很多學者報道與LMNA基因突變有關的FDCM患者，一般有嚴重的充血性心力衰竭、竇性心律失常、房顫、傳導系統病變、孤立性左心肌致密化不全，需要安裝心臟起搏器及具有較高的猝死風險等相似特征[15]。該家族擴張型心肌病具有以上相似的特點。目前已經在FDCM患者體內發現了20多種不同的突變基因。這些基因影響肌節蛋白、細胞骨架蛋白、離子通道蛋白和線粒體[1，16－18]。許多這些突變在少數的病人已經被發現。我們針對該家族成員的LMNA的12個外顯子進行基因檢測，雖然未發現12個外顯子的基因突變，但為探索該家族性擴張型心肌病異常基因向前邁進了一大步。

圖2 Results of DNA Sequencing analysis showing spectrum of exon 9（a）and exon 11（b）of the LMNA gene.

FDCM相關其他基因Emerin，nesprin和LAP－α都是核膜相關蛋白。典型的伴X染色體遺傳的病人表現為骨骼肌無力和肌攣縮。人和大鼠體內的LAP－α基因突變可引起心肌病。Nesprin－1和nesprin－2基因突變已經被用來區分肌營養不良和心肌病。肌節是引起肌肉收縮的基本單位，由粗細肌絲構成。粗肌絲主要由肌球蛋白和肌球蛋白結合蛋白構成。細肌絲主要由肌動蛋白，α－原肌球蛋白和肌鈣蛋白構成。肌節基因突變引起肥厚型心肌病和擴張型心肌病。肌節基因突變已在25%的先天性擴心病和10%的FDCM的病例中發現[19]。在心肌和骨骼肌中，抗萎縮蛋白將肌纖維膜蛋白連接在胞質γ－肌動蛋白上以穩定質膜。一項貝克肌肉萎縮癥的基因分析結果，抗肌萎縮蛋白的區域突變易于患心肌病[20]。肌聚糖（α，β，γ和δ）是一組和抗肌萎縮蛋白相互作用的肌跨膜糖蛋白。肌聚糖的基因突變可引起常染色體隱性的肢帶肌營養不良，表現為漸進式的早發肌無力，引起嚴重的 DCM[21－24]。Z盤（即Z線）是相鄰兩個肌節的分界線。它為肌動蛋白纖維和肌聯蛋白提供錨定位點，是協調相鄰的肌原纖維收縮而產生收縮力的主要管道。膜磷蛋白（由PLN基因編碼）是存在于心肌細胞內質網上的由蛋白質激酶磷酸化的膜蛋白，抑制心肌肌漿網的環磷酸腺苷泵出。PLM的R14缺失與有變異性傳導系統疾病的輕重度心肌病相關，并強調變異與DCM相關[25－27]。心肌鈉通道基因（SCN5A）突變被傳統定義為長QT間期綜合征Ⅲ型[28]。另外一種截然不同的DCM發病機制，是通過介導基因轉錄輔助因子與RNA結合進行調控。人心肌錨蛋白重復域1（ANKRD1）由CARP基因編碼，是一種定位在肌節I帶（明帶）的轉錄輔助因子，并成為肌聯蛋白－N2A機械感覺單元的一部分。最近一項研究發現，ANKRD1基因突變是散發的DCM和1.9%的家族性DCM的原因[29]。EYA4基因突變預示耳蝸和心臟基因表達會發生改變，是患者感音神經耳聾的DCM患者的病因[30]。核糖核酸結合蛋白（RBM20）的突變是導致家族性DCM傳導缺陷的原因。RBM20突變基因已在3%的DCM病例，5%的家族性DCM病例和13%的猝死病例中發現[31]。按照DCM基因檢測指導方針[32]進行家族成員的基因探索。對發現基因突變的高危家族成員，建議在癥狀出現前進行基因測序，這是一種對高危家族成員的監控法，其費用要比反復的影像學檢查少得多。我們對該FDCM家系將就導致FDCM的其他相關基因繼續進行探索。

基因篩查是確定FDCM家族最佳的方法之一，如果能確定特定的突變基因，可設計相應的引物或探針對FDCM高危家族或人群行基因學診斷或胎兒的產前診斷。對家族成員下代的健康具有重要意義。國外對已發生FDCM的家族成員開展基因篩查，對散發病例和新發病例的患者及家族成員也應該進行基因篩查，國內目前還未做到。太多的突變基因沒有被確定，并且廣泛篩查的敏感性不夠[33]。對FDCM進行廣泛的基因篩查任重而道遠。

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